LC-MS/MS를 이용한 식물생장조절제 동시분석법 연구

표준품 및 시약

표준품 forchlorfenuron (순도 98.7%), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (순도 99.5%) 및 thidiazuron (순도 99.5%)은 Chem Service Inc. (West Chester, PA, USA)에서, paclobutrazol (순도 99.9%), gibberellin A₃ (순도 98.6%)는 HPC Standard GmbH (Cunnersdorf, Germany)에서, uniconazole (순도 98.0%)은 Toronto Research Chemicals (Toronto, Ontario, Canada)에서 구입하였다. 표준원액은 잔류농약분석용 등급의 methanol (순도≥ 99.8%)(Kanto Chemical Co., Inc., Tokyo, Japan)로 희석하여 제조하였고 기기분석용 표준용액은 acetonitrile로 희석하여 0.5-100 ng mL^－1 범위에서 사용하였다.

Acetonitrile (순도 ≥ 99.9%)은 농약분석용 등급으로 Carlo Erba Reagents S.A.S. (Milano, Italy) 제품을 사용하였고 formic acid (순도 ≥ 98%)는 Kanto Chemical Co., Inc. (Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다. QuEChERS EN 1566법 적용을 위해 1차 추출시 사용한 KSO-8909 키트(4.0 g MgSO₄, 1.0 g NaCl, 1.0 g sodium citrate tribasic dihydrate (SCTD), 0.5 g sodium citrate dibasic sesquihydrate (SCDS))와 1차에서 원심분리된 상등액의 방해물질을 제거하는 KSO-9508 키트(0.15 g endcapped C18 sorbent (C18E), 0.9 g MgSO₄, 0.15 g primary/secondary amine (PSA))는 Phenomenex Inc. (California, USA) 제품을 사용하였다. LC/MS-MS용 이동상 용매로 증류수, methanol 그리고 formic acid는 LC/MS 등급의 Fisher Chemical (Geel, Belgium)제품을, ammonium formate (순도 > 99.0%)는 Sigma Aldrich Inc. (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.

분석기기 및 장치

전처리과정에서 시료 블랜더(robot coupe blixer 5 plus, Vincennes, France)와 원심분리기 sorvall ST16 (Thermo Fisher Scientific Inc., Osterode, Germany)을 사용하였다.

분석장비로 ultra performance liquid chromatography (UPLC)는 Thermo Fisher Scientific사의 vanquish column compartment H (Germering, Germany)를 사용하였다. MS/MS는 전기 분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 방식을 이용하는 TSQ 알티스 삼중 사극자 질량분석기로 Thermo Fisher Scientific사(San Jose, CA, USA)를 이용하였다. 컬럼은 Thermo Fisher Scientific사의 accucore aQ (2.1 × 100 mm, 2.1 μm, USA)로 사용하였고, 컬럼온도는 30^oC를 유지하였다. 상세한 분석조건은 Table 2와 같다.

Table 2.

Analytical conditions of LC-MS/MS

LC-MS/MS 이온화 조건

식물생장조절제 7종 성분의 LC-MS/MS 최적조건을 알아내기 위해 1 μg mL^－1로 조제한 각각의 표준품을 10μL min^－1 유속으로 주입하였다. 일정한 유속으로 주입된 성분이 안정화된 것을 크로마토그램으로 확인 후 분석성분의 이온화 모드 positive와 negative 조건을 확인하였다. 최적의 precusor ion을 선택한 후 스캔모드에서 collision energy값을 변경하면서 감도가 좋은 2개의 product ion을 선택하였다.

시료 전처리

시료를 블랜더로 균일하게 갈아 5.0g을 취하여 1% formic acid가 첨가된 acetonitrile 30 mL를 넣고 2분간 진탕하였다. 여기에 extraction kits 6.5 g을 넣고 2분간 격렬히 흔들어 주고 4^oC, 5분 냉각 후 혼합물을 4000 rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 상층액 6mL를 취하여 d SPE kits 1.2 g을 넣고 30초간 격렬히 혼합하고 4^oC, 5분 냉각 후 4000 rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 상등액을 0.2 μm nylon filter로 여과하여 LC-MS/MS 장비로 분석하였다.

분석법 유효성 검증

유효성 검증은 DG SANTE (2017)와 ICH (2005)를 근거로 하여 수행하였다. 매질효과(matrix effect, ME), 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 정확성(accuracy)과 정밀성(precision)을 평가하였다(DG SANTE, 2017; ICH, 2005).

매질효과는 5단계 농도의 solvent calibration와 matrix-matched calibartion을 사용하여 확인하였다. 매질효과는 다음과 같이 계산하였다

$$ \mathrm{M}\mathrm{E}\mathrm{ }\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{\begin{array}{c}(\mathrm{s}\mathrm{l}\mathrm{o}\mathrm{p}\mathrm{e}\mathrm{ }\mathrm{o}\mathrm{f}\mathrm{ }\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{r}\mathrm{i}\mathrm{x}\mathrm{ }\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{c}\mathrm{h}\mathrm{e}\mathrm{d}\mathrm{ }\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{l}\mathrm{i}\mathrm{b}\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{o}\mathrm{n}-\\ \mathrm{s}\mathrm{l}\mathrm{o}\mathrm{p}\mathrm{e}\mathrm{ }\mathrm{o}\mathrm{f}\mathrm{ }\mathrm{s}\mathrm{o}\mathrm{l}\mathrm{v}\mathrm{e}\mathrm{n}\mathrm{t}\mathrm{ }\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{l}\mathrm{i}\mathrm{b}\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{o}\mathrm{n})\times 100\end{array}}{\mathrm{s}\mathrm{l}\mathrm{o}\mathrm{p}\mathrm{e}\mathrm{ }\mathrm{o}\mathrm{f}\mathrm{ }\mathrm{s}\mathrm{o}\mathrm{l}\mathrm{v}\mathrm{e}\mathrm{n}\mathrm{t}\mathrm{ }\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{l}\mathrm{i}\mathrm{b}\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{o}\mathrm{n}}$$

검출한계와 정량한계는 공시료에 5단계 농도가 되도록 혼합표준용액을 첨가하여 5회 반복 실험한 회귀선 y절편의 표준편차와 검량선의 기울기를 이용하여 구하였다. LOD = 3.3SD / S로 LOQ = 10SD / S 식으로 계산하였다(SD : 회귀선 y절편의 표준편차, S : 검량선의 기울기).

정확성과 정밀성은 공시료에 3단계 농도(10 ng mL^－1, 50 ng mL^－1 and 75 ng mL^－1) 수준이 되도록 혼합표준용액을 첨가하여 3회 반복 실험한 회수율과 상대표준편차로 평가하였다. 회수율은 첨가된 농도값에 대한 matrix matched calibration 측정값의 비율로 다음과 같이 계산하였다.

$$ \mathrm{R}\mathrm{e}\mathrm{c}\mathrm{o}\mathrm{v}\mathrm{e}\mathrm{r}\mathrm{y}\mathrm{ }\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{\begin{array}{c}\mathrm{m}\mathrm{e}\mathrm{a}\mathrm{s}\mathrm{u}\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{d}\mathrm{ }\mathrm{c}\mathrm{o}\mathrm{n}\mathrm{c}\mathrm{e}\mathrm{n}\mathrm{t}\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{o}\mathrm{n}\mathrm{ }\mathrm{b}\mathrm{y}\mathrm{ }\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{r}\mathrm{i}\mathrm{x}\\ \mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{c}\mathrm{h}\mathrm{e}\mathrm{d}\mathrm{ }\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{l}\mathrm{i}\mathrm{b}\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{o}\mathrm{n}\times 100\end{array}}{\mathrm{s}\mathrm{p}\mathrm{i}\mathrm{k}\mathrm{e}\mathrm{d}\mathrm{ }\mathrm{c}\mathrm{o}\mathrm{n}\mathrm{c}\mathrm{e}\mathrm{n}\mathrm{t}\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{r}\mathrm{i}\mathrm{o}\mathrm{n}}$$

LC-MS/MS 분석조건

표준용액을 이용하여 확인한 7종 식물생장조절제의 이온크로마토그램은 Fig. 1과 같고 MS/MS의 최적화 된 조건값은 Table 3과 같다

Fig. 1.

Selected reaction monitoring (SRM) analyzed with 5 ng mL－1 concentration of plant growth regulator standards.

Table 3.

Optimized selected reaction monitoring (SRM) transitions of the seven plant growth regulators

추출용매 비교

10 g의 시료에 10 mL acetonitrile이 추출용매로 사용되는 QuEChERS법은 수분이 많은 포도 등 과일에는 적합한 시험법으로 알려져 있다(Brithish Standard, 2008). 하지만 위시험법은 상대적으로 수분함유량이 적은 엽채류의 경우 시료량에 비해 추출 용매량이 적어 효율이 떨어질 수 있다. 시료무게와 추출용매가 같은 비율인 QuEChERS법 보다 5.0 g을 30mL에 추출하는 방법으로 변경하여 추출효율을 향상시키고, 정밀성이나 정확성 오류의 원인이 되는 matrix effect 문제를 시료의 희석으로 줄이고자 하였다(Patel, 2011).

산성 농약성분의 경우 QuEChERS법에서 제시하는 acetonitrile보다 1% formic acid가 포함된 acetonitrile을 이용하여 추출하였을 경우 효율이 향상되었다는 보고가 있어(EURL-SRM, 2015) 두 가지 방법을 채소류 중에는 겨자채로, 과일류 중에는 포도로, 두채류 중에는 콩나물로 선정하여 추출효율을 비교하였다.

acetonitrile과 1% formic acid를 함유한 acetonitrile의 추출효율을 비교한 결과, 대부분 1% formic acid가 첨가된 acetonitrile 추출에서 안정된 추출효율을 나타내었다. 특히 2,4-dichlorophenoxyacetic acid는 acetonitrile을 추출용매로 사용했을 때 겨자채 3.79%, 포도 5.33%, 콩나물 1.83%로 낮은 추출효율을 나타내었다. 반면 1% formic acid가 포함된 acetonitrile로 추출하였을 경우 겨차채 102.26%, 포도 81.31%, 콩나물 100.01%의 추출효율을 나타내었다. 또한 gibberellin A₃는 acetonitrile을 추출용매로 사용했을 때 모든 제품에서 추출되지 않았으나 1% formic acid가 포함된 acetonitrile로 추출하였을 때 겨자채 100.56%, 포도 85.94%, 콩나물 98.29%로 확연하게 향상된 추출률을 보였다(Table 4). 그러므로 1% formic acid를 첨가한 acetonitrile을 추출용매로 선택하고 유효성 검증을 실시하였다.

Table 4.

Comparison of extraction efficiency for the seven plant growth regulators with two solventsa)

분석법 유효성 검증

시료별 식물생장조절제에 대한 매질효과는 Table 5와 같다. 매질을 보정한 검량선(matrix matched calibration)의 범위를 겨자채와 콩나물의 경우 0.5-100 ng mL^－1 범위에서, 포도는 1-100 ng mL^－1 범위에서 확인한 결과, 결정계수(determination coefficient, R²)는 모두 0.99 이상이었다.

Table 5.

Matrix-effect (ME) and determination coefficient (r2) of the seven plant growth regulators in mustard leaf, grape and bean sprout

LC-MS/MS분석은 식품 성분에 따라 matrix-effect를 받는 것으로 알려져 있다(Patel, 2011). 이는 분석물 추출시 기질에 포함된 지질, 단백질, 염 등이 동시에 용출되어 질량분석기 검출기에 도달하는 이온의 양이 감소하는 이온억제(suppression)와 반대로 증가하는 이온상승(enhancement) 현상이 나타날 수 있다(Moon et al., 2020). 본 연구방법에서는 매질효과가 겨자채에서는 forchlorfenuron이 21.4%로 이온억제효과가 크게 나타났으며 다음으로 uniconazole이 11.6%의 이온억제를 보였고 그 외 성분은 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 반대로 포도에서는 이온상승효과가 GA₃는 16.9%, 2,4-D는 15.1%로 나타났고, 콩나물에서는 이온상승이나 이온억제효과를 보이는 성분이 없는 것으로 확인되었다. 위 결과는 SANTE 가이드라인에서 제시한 ME (%) < ± 20 조건을 대부분 만족하였으나 겨자채에서 forchlorfenuron이 21.4%의 이온억제(suppression)를 보여 정량시 matrix matched calibration으로 확인하였다. Kim et al. (2016)의 결과와 비교해 볼 때 본 연구결과가 매트릭스 영향을 크게 받지 않는 이유는 추출을 위한 충분한 용매의 희석으로 인한 것으로 생각된다.

매질을 보정한 검량선(matrix matched calibration)의 직선성 범위는 겨자채와 콩나물은 0.5-100 ng mL^－1이며, 포도의 범위는 1-100 ng mL^－1이다. 검출한계는 겨자채에서 0.2-1.8 ng mL^－1, 포도 0.7-3.0 ng mL^－1, 콩나물 0.2-2.6 ng mL^－1이었고, 정량한계는 겨자채가 0.6-5.4 ng mL^－1, 포도 2.0-9.2 ng mL^－1, 콩나물 0.7-7.8 ng mL^－1을 나타내었다(Table 6).

Table 6.

Matrix matched linear range, LOD and LOQ of the seven plant growth regulators in mustard leaf, grape and bean sprout

정확도(accuracy)와 정밀도(repeatability)는 시료별 3단계 농도의 회수율과 상대표준편차를 통해 검증하였다. 회수율은 직선성의 범위내에서 모든 성분이 정량범위가 가능한 농도를 고려하여 3단계 농도로 선택하였다. 회수율을 3단계 농도로 3반복 분석한 결과, 저농도 10 ng mL^－1는 겨자채 86.1-105.5%, 포도 73.7-103.8%, 콩나물 79.0-94.7% 이었다. 중간농도 50 ng mL^－1는 겨자채 78.3-101.2%, 포도 72.3-93.6%, 콩나물 72.8-93.2% 범위였다. 고농도 75 ng mL^－1는 겨자채 80.7-102.6%, 포도 78.1-96.2%, 콩나물 78.0-97.5%로 나타났다. 상대표준편차는 저농도 10 ng mL^－1에서 겨자채 1.1-9.3%, 포도 2.0-7.5%, 콩나물 0.7-7.2% 범위였다. 중간농도 50 ng mL^－1에서 겨자채 0.2-5.2%, 포도 1.1-8.9%, 콩나물 0.9-4.9% 이었다. 고농도 75 ng mL^－1에서 겨자채 0.8-3.0%, 포도 0.4-2.2%, 콩나물 0.7-4.5% 이었다(Table 7). 이 결과는 SANTE 가이드라인에서 제시한 유효범위인 회수율 70-120%, RSD≤20%를 충족하였다.

Table 7.

Recovery of the seven plant growth regulators in mustard leaf, grape and bean sprout

잔류농약 실태조사

작물보호제 지침서에 따른 식물생장조절제 사용 대상 품목 중 겨자채 등 농산물 68건을 수거하여 7종 식물생장조절제 잔류량을 앞서 검토한 동시분석법으로 조사하였다. 7종중 paclobutrazol 1종만이 겨자채 등 3품목에서 잔류허용기준 이내로 검출되었다. 포도, 사과, 콩나물과 숙주나물에서는 7종 모두 검출되지 않았다(Table 8).

Table 8.

Residues of the seven plant growth regulators in agricultural products

겨자채는 13건 중 11건에서 paclobutrazol이 0.05-2.31 mg kg^－1 농도로 검출되었다. 케일은 13건 중 7건에서 0.12-1.10 mg kg^－1 농도로 잔류하였다. 셀러리는 12건 중 2건에서 0.02 mg kg^－1, 0.44 mg kg^－1 검출되었다. 출하시기 조절이 가능하고 상품가치를 극대화하는 이점이 있는 paclobutrazol이다양한 농도범위로 검출되는 것은 살포시기나 살포량, 수확시기 그리고 기후 환경에 따른 영향으로 생각된다. Table 8의 결과에서 식물생장조절제 중 GA₃나 2,4-D가 검출되지 않은 이유는 다른 농약에 비해 불안정한 특성으로 살포 후 단기일에 소실한 것으로 보이며, 잔류농약 허용기준이 없는 uniconazole은 과거 유통 전 검사로 검출된 제품의 신속한 행정 처리와 지속적인 모니터링으로 사용량이 줄어든 것으로 보인다. 또한 uniconazole의 대체제로 paclobutrazol의 사용이 증가함에 따라 uniconazole 사용이 감소된 것으로 추정된다.

이번 연구에서 paclobutrazol의 검출률이 겨자채의 약 80% 이상, 케일의 약 50% 이상으로 나타나 병충해가 상대적으로 심한 케일의 경우 농약의 잔류가 높다고 보도한 내용과 일치하는 결과를 보인다(EWG, 2019). 겨자채와 케일은 건강채소로 주목받고 있으며 착즙쥬스 원료 및 쌈채류로 소비되는 생식용 채소이다. 향후 생식용 채소류에 대한 식물생장조절제의 검사 범위를 확대하여 지속적인 모니터링을 실시하고 잔류량이 높은 경우 시민안전을 위한 관리정책이 필요하다. 특히 겨자채의 경우 농약 사용시 잎의 모양이 굴곡지고 거친 표면의 특성상 다른 채소보다 잔류량이 더 오래 지속될 가능성도 있으므로, 생산자를 대상으로 작물보호제의 적절한 살포량과 살포시기 등 정기적인 농약안전사용 교육도 실시되어야 한다.