국내 꿀벌 반야외시험법 유효성 검증을 위한 무처리군 및 양성대조군 주요 데이터 분석

터널 및 시험 디자인

국립농업과학원(NAS)(35°49'40.7 "N, 127°02'44.9"E) 야외 시험 포장에 9동의 망사 터널을 설치하였다(Fig. 1). 각 터널은 크기가 14 × 5 × 3 m (L×W×H)이었고 너비가 3 mm 이하인 망사로 씌었다. 시험작물은 국내에서 흔히 볼 수 있고 화분활동에 적합한 유채꽃으로 선정하였다. 국립식량과학원 바이오에너지작물 연구소에서 유채(탐미) 종자를 분양 받아 매년 10월에 파종하였으며 다음 해 유채가 약 1m 높이로 자라고 80% 이상 만개할 때 시험을 시작하였다. 각 처리군은 무처리군, 양성대조군, 시험물질 처리군으로 구성하였으며 각 처리군별 3반복 시험하였다. 죽은 벌의 수집이 용이하게 땅을 고르게 하고 터널의 앞, 뒤, 중간에 길을 만들어 흰 부직포로 덮어주었다. 각 터널 안에 수조를 배치하여 꿀벌에게 물을 공급하였고 농약 살포 시에는 수조를 터널 밖으로 이동시켜 오염되지 않도록 하였다. 꿀벌 반야외시험은 2016년부터 2020년까지 매년 1회씩 진행하였으며 무처리군은 수돗물을, 양성대조군은 dimethoate 유제 46%와 diflubenzuron 수화제 25%를 사용하였다. Dimethoate는 유기인계 살충제이며 acetylcholinesterase (AChE) 저해제이다. 꿀벌 접촉 및 섭식독성 LD₅₀ 값은 각각 0.1 μg/bee로 꿀벌 독성이 매우 높다(Pesticide Properties DataBase, PPDB). Diflubenzuron은 benzoylurea계통의 IGR계 살충제로 키틴 합성 저해제로 작용하며, 유충의 정상적인 탈피를 방해하여 살충효과를 낸다(EFSA, 2015). 꿀벌 접촉 및 섭식독성 LD₅₀ 값은 각각 > 74.2 μg/bee, > 9.1 μg/bee 이다(Pesticide Properties DataBase, PPDB).

Fig. 1.

Design of the tunnel (modified from Chon et al., 2017)

양성대조군 dimethoate 유제의 경우 선행연구(Miles et al., 2012)에서 사용한 약량을 기준으로 살포량을 설정하였으며 diflubenzuron 수화제의 경우 꿀벌 반야외시험에서 사용한 선행연구가 없었기 때문에 야외시험에서 diflubenzuron 400 g a.i./ha를 처리하였을 때 꿀벌 brood에 대한 영향이 없었다는 연구결과(Tasei, 2001)를 바탕으로 살포량을 설정하였다. 무처리군은 꿀벌 비행활동이 활발한 시간에 수돗물(400 L/ha)을 살포하였다. 2016년에는 양성대조군으로 dimethoate 유제(400 g a.i./ha in 400 L tap water/ha), diflubenzuron 수화제(600 g a.i./ha in 400 L tap water/ha)를 사용하였다. 2017, 2018, 2019년에는 양성대조군으로 diflubenzuron 수화제(800 g a.i./ha in 400 L tap water/ha)를 사용하였다. 2020년에는 dimethoate 유제(600 g a.i./ha in 400 L tap water/ha)를 살포하였다. 농약 살포시에는 충전식 농약 분무기를 사용하였고(MSB-100S, Maruyama, Japan) 시험작물에 고르게 농약이 살포되도록 충분한 연습을 하였다. 농약살포 후 7일 동안 터널 안에서 관측하고 마지막 터널 관측일 날 저녁에 9개의 벌통을 2 km 떨어진 터널 밖 장소로 이동하였다. 꿀벌의 치사 개체 수, 비행활동, 난 유충 발육도를 28일의 시험기간 동안 평가하였다.

기후 조건

9동의 터널 구역과 약 1 km 떨어진 국립농업과학원 내 기상 관측소의 온도, 상대습도, 강우량 데이터를 시험기간 동안 매일 기록하였다.

봉군 준비

시험 봉군은 약 7000~9000마리의 건강하고 상태가 좋은 벌을 양봉농가(의령)에서 구입하여 사용하였다. 시험봉군은 양봉농가에서 월동기간부터 시험 시작 하루 전까지 전문적으로 관리하였으며 각 봉군은 2-3장의 산란판, 1개의 봉판, 1-2장의 먹이판으로 구성하였다. 시험 시작 한 달 전부터 응애 및 질병방제를 위한 약제 및 화학물질 처리를 금지하였고 시험물질 살포 최소 3-4일 전부터 망사 터널에 입식하여 터널 환경에 적응하도록 하였다. 터널 입식 후 각 벌통 입구에 dead bee trap을 설치하였다.

꿀벌 치사 개체 수

Table 1에 제시된 일정(Chon et al., 2018)에 따라 죽은 일벌은 터널 중간, 앞, 뒤 시트 및 벌통 앞과 dead bee trap에서 수집하였다.

Table 1.

Evaluation of mortality of honey bees

비행활동

각 터널 당 3개의 1m² 구획을 지정하여 꿀벌 비행활동을 관찰하였다. Table 2에 제시된 일정에(Chon et al., 2018) 따라 꽃 주위를 날아다니는 벌(flying)과 화분매개 활동하는 벌(flowering)를 짧은 시간 동안(예: 10-15초) 측정하였다.

Table 2.

Evaluation of flight activity

산란 평가(Brood assessment)

난 유충 발육도 관측을 위해 포토박스를 이용하여 각 봉군당 BFD (brood area fixing day) 0일 날 알 200개를 지정한 소비판을 촬영하였다. 포토박스에서 촬영한 소비판 이미지는 Microsoft PowerPoint 2010로 분석하였다. 난 유충 발육도를 평가하기 위해 알을 원 모양의 셀로 지정하였다. 처음 촬영한 사진(BFD 0)에서 지정된 셀을 그룹으로 설정한 후 다음 BFD 관측일 날(BFD +5, +10, +16, +22(±1))에 촬영한 소비판 이미지 위에 겹쳐놓아 셀 분석을 수행하였다. 지정된 셀의 난 유충 발육단계를 평가하기 위해 0에서 5의 점수를 다음과 같이 부여하였다. 0: 발달 종료, 1: 알(egg), 2: 어린유충(L1-L2), 3: 노숙유충(L3-L5), 4: 번데기, 5: 우화 후 빈 셀, 알 또는 어린 유충으로 채워진 셀, N: 꿀(nectar), P: 화분(pollen). Table 3에 평가일 별 예상 산란 단계를 나타내었다(Chon et al., 2018).

Table 3.

Expected brood stage at each assessment day for eggs at BFD 0

포토박스(Photobox)

포토박스는 선행연구 Chon et al. (2017, 2018)에서 묘사한대로 소비판 관찰을 위해 제작하였다. 포토박스 크기는 1.2 × 0.6 × 1.5 m (L ×W× H)이었고 소비판 홀더로 소비판을 고정하였다. NIKON D300S 카메라(AF-S NIKKOR 18-105 mm 1:3.5-5.6G ED 렌즈)를 이용하여 소비판을 촬영하였다. 카메라는 exposure time 1/6s, aperture 4.5, ISO 200, F-number F/5.0, focal length 50 mm로 설정하였다.

터널 당 봉군에서 소비판을 이동하여 사진촬영을 한 후 다시 벌통에 넣을 때까지 5분 이내의 시간이 걸렸다.

Brood termination rate (BTR)

BTR은 꿀벌 반야외시험의 유효성을 나타내는 중요한 지표로서 지정된 알의 발달 실패율을 나타내며 아래 식과 같이 계산하였다.

Brood index (BI) and compensation index (CI)

BI는 난 유충 발달의 지표이며 각 봉군마다 BFD 관측 일자에 계산을 하였다. BFD 평가 일정에 예상되는 발달 단계에 도달한 셀은 1부터 5까지 점수를 부여하였다. 지정된 알이 각 BFD 관측 일자에 따른 정상 발달 단계에 도달하지 못했으면 다시 셀이 산란에 이용되는 여부와 상관없이, BFD 평가일과 평가일 이후에도 0점 처리하였다. 각 봉군의 BI는 BFD 관찰 일자 별로 평가된 셀의 값을 모두 합한 후 관찰된 전체 셀의 수로 나누어 구하였다.

CI는 봉군 회복의 지표이며 각 봉군마다 BFD 관측 일자에 계산하였다. 셀은 평가일에 확인된 발달단계만을 토대로 1부터 5점까지 점수를 부여하였다. BI와 달리 셀이 BFD 평가일에 해당하는 정상 발달단계에 도달하지 못해도 셀 안에 다른 산란이 있어 발육단계(알, 유충, 번데기)가 있으면 해당 점수를 부여하였다. 각 봉군의 CI는 BFD 관찰 일자별로 평가된 셀의 값을 모두 합한 후 관찰된 전체 셀의 수로 나누어 구하였다.

통계

통계분석은 IBM SPSS 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하였다. 데이터는 Shapiro-Wilk’s test을 사용하여 정규성 검정을 수행하였고, Levene의 등분산 검정(Levene’s test) 하였다. Dunnett’s t-test을 사용하여 치사 개체수(> control), 비행활동 개체수(< control), BTR (> control), BI (< control), CI (< control)을 비교하기 위해 다중비교(α = 0.05)를 수행하였다.

기상조건

Table 4는 꿀벌 반야외시험을 수행한 5년(2016-2020) 동안의 기상데이터를 보여준다. 2016년은 4월 15일부터 5월 13일까지, 2017년은 4월 18일부터 5월 17일까지, 2018년은 4월 23일부터 5월 21일까지, 2019년은 4월 16일부터 5월 14일까지, 2020년은 4월 7일부터 5월 6일까지 시험을 진행하였다. 시험기간 동안 2016년은 12회, 2017년은 8회, 2018년은 9회, 2019년은 5회, 2020년은 6회 비가 내렸다. 터널 노출기간 동안 낮 기온은 15.9-24.9^oC (2016년), 18.8-24.2^oC (2017년), 15.5-25.9^oC (2018년), 10.1-28.3^oC (2019년), 11.3-23.8^oC (2020년)이었다. 2016년도에는 농약 살포일 날 밤에 약 1 mm의 비가 내렸고 3일 후 31 mm의 비가 내렸다. 2017년도에는 농약 살포 후 3일 날 0.5 mm의 매우 적은 양의 비가 내렸고 4, 5일날에 비가 내렸다. 2018년도에는 농약 살포 후 6일 날 비가 38 mm 내렸고 2019년은 4일 후에 20 mm의 비가 내리고 살포 후 5, 6, 7일날 비가 내렸다. 2020년에는 농약 살포 후 7일에 4.5 mm의 비가 내렸다. OECD No.75 시험법에서는 기상조건 항목에 낮 시간 동안 기온이 < 15^oC, > 30^oC 인 날을 피하고 우기(rainy periods)를 피하라고 명시되어있다. 국내에서 시험한 5년 동안의 기상조건은 대부분 OECD 시험조건에 부합하였다. 2016년의 경우 갑작스럽게 농약살포 10시간 후에 비가 1 mm 내렸지만 나머지 수행년도에서는 살포 후 최소 3일 이후에 비가 내렸다. 또한 2019년, 2020년 터널 관찰 기간 동안 낮 최고기온이 10.1^oC, 11.3^oC 인 날 하루를 제외하고 6일 동안은 모두 15^oC 이상이었다. 농약 살포 후 터널 노출 기간 동안 최대한 비를 피해야하지만 국내 4-5월 날씨의 경우 비를 피해서 시험일정을 정하는 것은 매우 어려운 일이다. 따라서 농약 살포일 당일이나 다음날까지는 최대한 비를 피할 수 있도록 일정을 조절해야한다.

Table 4.

Climatic conditions during honeybee semi-field study from 2016 to 2020

꿀벌 치사 개체수

Table 5는 2016~2020년 꿀벌 반야외시험 무처리군, 양성대조군의 꿀벌 치사 개체수를 보여준다. 무처리군은 터널 내부에서 평균 치사 개체수가 70.8~269.4마리였다. Dimethoate 처리군은 터널 내 관찰기간 동안 농약살포 후 평균 치사 개체수가 각각 257.6, 607.7마리였다. Diflubenzuron 처리군은 터널 내 평균 치사 개체수가 58.1~190.7마리였다. 2016년에 수행된 시험의 dimethoate 처리군은 터널 노출기간 동안 평균 꿀벌 치사개체수가 607.7마리로 무처리군에 비해 약 9배 이상 증가하였다. Diflubenzuron 처리군의 평균 꿀벌 치사 개체수는 무처리군과 통계적으로 유의한 차이가 없었으며 이는 diflubenzuron이 IGR 계열 농약으로 꿀벌 성체 치사 개체수에 영향을 주지 않았기 때문이다. 꿀벌 반야외시험은 망사 터널 안에 벌통을 배치하여 시험을 하기 때문에 벌들이 닫힌 공간에 대한 스트레스를 받게 된다. 따라서 벌들 중 일부는 화분매개 활동을 하지 않고 터널 밖으로 나가려는 이상 탈출행동을 보이게 되며 결국 터널 천장에서 머물다가 죽게된다. 2020년 시험의 경우 시험물질 살포 전 무처리군의 평균 치사개체수가 양성대조군보다 통계적으로 유의하게 많았다. 이는 무처리군에서 외역벌 개체수가 다른 처리군보다 많아 상대적으로 터널을 탈출하려는 개체수가 많아서 기인한 것으로 추측하였다. 최근 SynTech Research (2019)에서는 꿀벌 반야외시험 수행시 터널 내 꿀벌의 스트레스를 감소시키는 방법으로 무처리군에서 벌통을 터널 중앙과 터널 끝(OECD 시험법 기준)에 배치하여 꿀벌 치사개체수를 비교하였다. 시험결과 터널 중앙에 벌통을 배치하였을 때 꿀벌 치사개체수가 통계적으로 유의하게 감소하여 봉군을 터널 중앙에 배치하는 것을 제안하였다. 2020년 시험의 무처리군에서 농약 살포 전 3일 동안 평균 치사 개체수가 양성대조군보다 상대적으로 많아 농약 살포 후 무처리군과 양성대조군의 치사 개체수를 비교하기가 어려웠다. 하지만 양성대조군(dimethoate)의 농약 살포 전과 후의 평균 치사 개체수를 비교할 때 살포 후에 치사 개체수가 유의적으로 증가한 것을 알 수 있었다.

Table 5.

Mortality of worker bees during the experimental phase

Miles (2003)은 spinosad 액상수화제(SC)의 꿀벌 영향을 평가하기 위해 꿀벌 반야외시험을 수행하였으며 diemthoate(400 g a.i./ha)를 양성대조군으로 처리하였을 때 평균 꿀벌 치사 개체수가 무처리군에 비해 살포 후 2일까지 통계적으로 유의하게 증가하였고, Dinter and Samel (2015)은 cyantraniliprole 유현탁제(SE)의 꿀벌 영향을 평가 하기 위해 반야외 시험에서 양성대조군을 dimethoate 유제를 사용하였으며 dimethoate (400 g a.i./ha)을 처리 후 7일 동안 꿀벌 치사 개체수가 무처리군에 비해 통계적으로 유의하게 증가하였다. Schur et al. (2003)은 독일에서 수행된 꿀벌 반야외시험 중 양성대조군으로 fenoxycarb (Insega 25WG)를 사용한 5개의 시험결과를 분석하였다. Fexnoxycarb 처리 후 꿀벌 치사개체수는 영향을 받지 않았지만 농약 살포 2주 후에 번데기 치사 개체수는 크게 증가하였다.

비행활동

Table 6은 2016~2020년 꿀벌 반야외시험 무처리군과 양성대조군의 비행활동 개체수를 나타낸다. 무처리군의 수돗물 살포 전 평균 비행활동 개체수는 14.7~24.5 마리였으며 살포 후 7일 동안 평균 비행활동 개체수는 13.7~25.4 마리였다. 양성대조군 dimethoate 처리군은 농약살포 후 비행활동 개체수가 2016년, 2020년에 각각 1.3, 0.5마리로 살포 전과 비교했을 때 현저하게 비행활동 개체수가 줄어들었다. 반면 diflubenzuron 처리군의 경우 비행활동 개체수가 살포 전 후 통계적으로 유의한 차이가 없었으며 무처리군과 비교 할때도 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 이는 dimethoate은 꿀벌 성체에 직접적으로 노출될 경우 치사를 일으키지만 diflubenzuron은 IGR계열로 꿀벌 성체보다 유충발달에 영향을 주는 농약이기 때문이다.

Table 6.

Flight activity of honey bees during the exposure phase in the treatments

Miles et al. (2012)는 spinosad가 꿀벌에 미치는 영향을 평가하기 위해 독일, 프랑스 등 유럽에서 수행한 10개의 꿀벌 반야외시험을 분석하였다. 분석결과 무처리군의 비행활동 개체수는 평균 15-20마리였지만 양성대조군 dimethoate 유제(400-600 g a.i./ha) 살포 후 7일 동안 비행활동 개체수가 5마리 이내로 크게 감소하였으며 이는 국내 시험결과와 비슷한 양상을 나타내었다.

Brood termination rate (BTR)

Table 7은 2016~2020년 꿀벌 반야외시험 무처리군과 양성대조군의 BTR 값을 나타낸다. 무처리군 BTR값은 20.5~47.3%이었다. 양성대조군 dimethoate 처리군의 BTR은 83.5, 97.3%이었다. Diflubenzuron 처리군의 BTR은 68.0~100% 이었다. 2019년은 무처리군의 BTR이 47.3%이었고 양성대조군(diflubenzuron)의 BTR 값은 75.2%이었으며 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 2019년 시험수행 시 유채 균핵병 발생으로 만개한 유채 꽃 면적이 상대적으로 작았으며 먹이 부족으로 인해 무처리군의 BTR 값이 높게 나온 것으로 예측한다. 총 5회의 시험 중 4회의 무처리군 BTR 값이 약 30%의 값을 나타냈으며 이는 선행연구 결과와 비슷한 값을 나타내었다. 양성대조군 dimethoate 유제와 diflubenzuron 수화제 처리군 모두 BTR값이 68.0% 이상 나왔고 양성대조군 6개 시험의 평균 BTR 값이 83.5%가 나와 국내 양성대조군 물질로 적절하다고 판단된다.

Table 7.

Brood termination rates of the marked cells in the case of eggs at BFD 0

독일과 스위스에서는 2011년에서 2014년까지 54개의 시험이 수행되었고 사용된 반복수(터널 수)는 208개였다. 무처리군과 양성대조군(fenoxycarb)의 BTR 값은 각각 29.2 ± 21.6%, 70.7 ± 27.4% 이었다. 무처리군의 BTR값이 30% 이하인 반복수는 전체의 61.5% 이었고 40% 이하는 76.9% 이었다. 양성대조군은 BTR 값이 70% 이상인 데이터가 전체 반복수 중 56.6% 이었다(Becker et al., 2015). Szczesniak et al. (2018)은 2014년부터 2017년까지 독일, 프랑스, 스페인, 미국에서 수행한 꿀벌 반야외시험의 무처리군 BTR 값을 분석하였으며 그 결과 독일(61개 시험), 프랑스(3개 시험), 스페인(5개 시험), 미국(17개 시험)의 BTR 값은 각각 30.2%, 19.4%, 41.8%, 50.6% 이었다. 미국과 스페인의 무처리군 BTR 값은 상대적으로 독일과 프랑스에 비해 높게 나타났다. 국내 무처리군(5개 시험, 15개 터널) 평균 BTR 값은 31.65%로 독일의 무처리군 BTR 값과 비슷한 결과를 나타내었다.

BTR은 시험의 유효성을 나타내는 중요한 결과 값이다. 무처리군에서 낮은 BTR 값은 좋은 시험 유효성을 나타낸다. 하지만 OECD 시험법에서는 시험유효성에 대한 구체적인 BTR 값을 제시하지 않고 있다. 유럽에서 무처리군의 유효성 기준으로 BTR < 30% 또는 BTR < 40% 기준은 여전히 논의 중에 있다.

Brood index (BI) and compensation index (CI)

Table 8은 꿀벌 반야외시험 5년 동안의 무처리군과 양성대조군의 BI 값을 보여준다. 무처리군 BI 값은 2.34~3.98이었다. 양성대조군 dimethoate 처리군의 BI값은 0.13~1.17이었다. Diflubenzuron 처리군의 BI 값은 0.00~1.75 이었다. 2019년은 무처리군의 BTR이 47.3%이었기 때문에 BFD+22 BI 값이 2.63으로 상대적으로 다른 년도에 수행한 시험 값보다 낮게 나왔다.

Table 8.

Brood index during the observation period

Table 9는 꿀벌 반야외시험 5년 동안의 무처리군과 양성대조군의 CI 값을 보여준다. 무처리군 CI 값은 2.52~4.55이었다. 양성대조군 dimethoate 처리군의 CI값은 0.67~1.95이었다. Diflubenzuron 처리군의 CI 값은 0.00~3.38 이었다. 다른 년도에 수행된 반야외시험에서 diflibenzuron처리군은 BFD+5에서 BFD+22까지 CI 값이 2이상으로 증가하는 경향을 나타냈지만 2018년도 diflubenzuron 처리군은 BTR 값이 100%로 BI 값도 0.00이었으며 CI값도 0.00~0.67로 난 유충 발육이 전혀 되지 않고 있었음을 알 수 있었다.

Table 9.

Brood compensation index during the observation period

Miles et al. (2012)의 유럽에서 수행된 꿀벌 반야외시험 분석결과에 의하면 양성대조군으로 fenoxycarb와 dimethoate을 사용하였을 때 두처리군 모두 CI가 BFD +6, +10, +15, +21에 모두 1보다 작거나 2 이하로 나와 무처리군에 비해 통계적으로 유의하게 작았다.

Schur et al. (2003)은 독일에서 수행된 5개 꿀벌 반야외시험 ring test 결과를 분석하였다. 5개의 시험분석 결과 BTR 값은 무처리군이 8-43%이었고 양성대조군이 94-100%이었다. 난 유충 발육도 분석결과 시험 3개의 무처리군에서 BI가 BFD+10일까지 증가하였지만 BFD+16, BFD +22 일에는 감소하는 경향을 나타냈다. 이는 여름에 기상악화로 비가 예상보다 자주 와서 벌통 내 먹이 부족현상으로 기인한다고 예측하였다. 양성대조군은 fenoxycarb (Insega 25WG)를 살포하였으며 무처리군에 비해 통계적으로 유의하게 BI값이 작았다. Brood에 심각하게 영향을 준 경우에는 양성대조군에서 BFD+5에서 BFD+22까지 BI 값이 0.00을 유지하였다.

국내에서 2016-2020년에 수행된 꿀벌 반야외시험 분석결과 양성대조군은 시험목적에 따라 dimathoate 유제 또는 diflubenzuron 수화제를 사용할 수 있을 것으로 판단된다. 두 양성대조군 모두 평균 BTR 값은 70%이상 나타났으며 무처리군의 BTR 값은 20.50~47.3%를 나타냈다. 꿀벌 반야외시험 무처리군 BTR 값은 2019년을 제외하고 약 31% 이하를 유지하였다. 하지만 반야외시험은 야외에서 진행되는 시험으로 날씨 등 다양한 변수들이 존재하기 때문에 2019년에 수행한 시험에서는 무처리군의 BTR 값이 45%이상 나왔으며 양성대조군과도 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 5년간의 시험결과를 볼 때 국내 꿀벌 반야외시험의 경우 BTR 값은 무처리군의 경우 40% 이하, 양성대조군은 70% 이상을 적절한 유효성 기준이라고 보여진다. 하지만 국내 데이터는 현재까지 시험횟수가 5회(반복수 15회)로 매우 적고 한 장소에서만 수행되었기 때문에 향후 국내 타기관과 함께 꿀벌 반야외시험 ring-test를 수행하여 합리적인 시험 유효성 기준을 제시하기 위한 국내 데이터 축적이 필요하다고 생각된다.

이해상충관계

저자는 이해상충관계가 없음을 선언합니다