야외집단 점박이응애에 대한 살비제 저항성 점 돌연변이 분석과 방제약제 선발

서 론

점박이응애(Tetranychus urticae)는 전 세계에 분포하며 1,000 종 이상의 원예 및 농업작물에 경제적 손실을 일으키는 주요 해충으로 알려져 있다(Lee et al., 2003; Van Leeuwen et al., 2013; Migeon and Dorkeld, 2019). 점박이응애는 주로 화학적 방제법에 의존하고 있으며(Van Nieuwenhuyse et al., 2009; Ilias et al., 2014), 현재 상업적으로 등록되어 있는 거의 모든 살비제에 대한 저항성이 발달되어 있는 것으로 보고되어 있다(Lee et al., 2010; Whalon et al., 2012). 특히 유전적인 돌연변이율이 다른 해충에 비해 높은 것으로 알려져 있고(Lee et al., 2004), 발육기간이 짧아 연간 발생 세대수가 많다. 이동성이 적어 살비제에 의한 도태의 기회가 많고, 근친교배가 일어나기 쉬우며, 외부로부터의 감수성 개체의 유입이 적으므로 살비제에 대한 저항성 발달이 다른 해충들에 비하여 빠르게 나타날 가능성을 지니고 있다(Khalighi et al., 2015; Ilias et al., 2017; Riga et al., 2017). 점박이응애의 다양한 약제에 대한 저항성은 전 세계적으로 문제가 되고 있으며(Stumpf et al., 2001), 단순히 한 가지 약제뿐만 아니라 교차저항성의 증가 및 복합저항성을 가진 집단이 많아지고 있다(Hollingworth and Dong, 2008; Khajehali et al., 2011; Van Leeuwen et al., 2013; Sparks and Nauen, 2015; Van Leeuwen and Dermauw, 2016; Koo et al., 2021). 절지동물문에서 살비제 저항성은 두 가지 주요 기작으로 이루어지는데, 무독화 효소의 양적 또는 질적 변화를 통한 약제 노출의 감소와 작용점의 돌연변이를 통한 표적 부위의 민감도 변화가 있다(Li et al., 2007; Feyereisen et al., 2015; Van Leeuwen and Dermauw, 2016; Sugimoto and Osakabe, 2019). 그중 작용점 돌연변이의 발생은 가장 흔히 일어나는 저항성 요인이나(Choi et al., 2020), 실내 연구 저항성 집단에서 발생하는 점 돌연변이가 야외 채집 저항성 집단에서 발생하지 않는 경우도 존재한다(Kim et al., 2019). 유전적으로 고정된 응애의 저항성 무독화 효소의 경우 곤충과 유사하게 esterases (EST), glutathione-S-transferases (GST)와 cytochrome P450 monooxygenases (P450)이 있다(Van Leeuwen et al., 2010). 저항성을 가진 응애의 방제는 시간이 많이 소요될 뿐 아니라 비용과 환경 오염의 증가가 있으므로 살비제 저항성의 기작에 대한 연구가 많이 필요하며(Price et al., 2000; Van Leeuwen et al., 2004), 신속한 저항성 모니터링은 살비제 및 살충제 저항성 관리에 있어서 필수적이다(Dennehy and Granett, 1984).

Abamectin은 강력한 살비, 살충 및 살선충 활성을 가지며 Streptomyces avermitilis의 발효 물질에서 파생된 화합물이다(Clark et al., 1995). 주 저항성 기작으로는 glutamate-gated chloride channel 1 (GluCl1)에서의 G314D와 glutamate-gated chloride channel 3 (GluCl3)에서의 G326E, 잠재 가능성을 보이는 GluCl3에서의 I321T, V327G, L329F가 있다(Kwon et al., 2010a). Bifenazate는 mitochondrial cytochrome b (cytb)의 complex III을 억제하여 세포의 에너지 이용을 방지하는 기작을 가지고 있으며(Van Leeuwen et al., 2010; IRAC, 2021), 저항성과 관련된 점 돌연변이는 Qo site의 cd1 helix에서 G126S, I136T, S141F가 있으며 ef-motif helix 에서 P262T가 있다(Van Leeuwen et al., 2008). Etoxazole은 chitin synthase 1 (CHS1)에 작용하는 성장억제제 또는 탈피억제제로써 성충에 대한 살비력은 낮고 약제 저항성 발달이 매우 빠른 약제이다(Tomlin, 2000; Kobayashi et al., 2001; Lee et al., 2003; IRAC, 2021). CHS1의 C-terminal transmembrane helix에서의 I1017F 점 돌연변이가 저항성과 관련이 있다고 밝혀졌다(Van Leeuwen et al., 2012; Herron et al., 2018). Fenpropathrin는 응애 및 곤충에 신경독성 작용을 하는 pyrethroid계 화합물로(Ryu et al., 1996), voltage gated sodium channel (vgsc)에 작용하는 약제이다(IRAC, 2021). 보고된 저항성의 주기작으로는 L1024V와 A1215D 등이 있으며, 특히 L1024V가 중요한 저항성 기작이라고 보고되었다(Kwon et al., 2010b). Pyflubumide는 미토콘드리아 복합체 II의 전자전달 저해를 통한 살비기작을 가지고 있으며(IRAC, 2021), P450 monooxygenase와 SdhB subunit에서 발생하는 점 돌연변이 I260V가 있다(Fotoukkiaii et al., 2020; Sugimoto et al., 2020). Pyridaben은 Nissan Chemical이 1984년에 발견하여 1991년에 상용화된 pyridazine 화합물로(Hirata et al., 1988), coenzyme site Q0에서 mitocondrial respiratory chain의 complex I에 결합하여 전자전달 저해를 통한 대사 억제 능력을 가진 살비제이다(Hollingworth and Ahammadsahib, 1995; Lümmen, 2007; IRAC, 2021). Mitochondrial electron transport inhibitors (METI)-I의 NADH 탈수소효소의 subunit PSST에서 점 돌연변이 H92R이 발생하는 것으로 보고되었다(Van Pottelberge et al., 2009; Bajda et al., 2017; Snoeck et al., 2019).

본 연구에서는 국내 7개 지역에서 채집된 점박이응애 집단(경주, 성주, 옥천, 칠곡, 평택1, 평택2, 홍성)의 7개 약제(abamectin, bifenazate, etoxazole, fenpropathrin, fenpyroximate, pyflubumide, pyridaben)에 대한 저항성 수준 평가와 fenpyroximate를 제외한 6개 약제저항성 유전자에서의 점 돌연변이(A1215D, G314D, G326E, G126S, H92R, I1017F, I260V, L1024V)의 발생 여부, 그리고 저항성 점박이응애 방제를 위한 우수한 약제를 선발하였다.

재료 및 방법

점박이응애

실험에 사용된 감수성(S) 계통은 농촌진흥청에서 분양 받아 2017년부터 약제 처리 없이 누대 사육한 것을 사용하였다. 야외에서 채집한 집단(칠곡, CG; 경주, GJ; 홍성, HS; 성주, SJ; 옥천, OC; 평택1, PT1; 평택2, PT2)은 실내에서 2주 이상의 기간을 두고 사육한 후 실험에 사용하였다(Table 1). 실내 사육조건은 온도 25~27^oC, 광주기 16L: 8D, 상대습도 40~60%의 조건으로 강낭콩 유묘를 먹이로 공급하여 사육하였다.

Table 1.

Information of T. urticae populations which collected in Korea

시험약제

실험에 사용된 살비제는 저항성 수준을 알아보기 위한 살비제 7종과 대체약제 선발용 살비제 4종, 총 11종으로 국내에 판매되고 있는 제품을 이용하였으며, 유효성분 및 제형과 추천농도는 다음과 같다(Table 2). 저항성 수준을 알아보기 위한 살비제는 abamectin, bifenazate, etoxazole, fenpropathrin, fenpyroximate, pyflubumide, pyridaben이며, 대안 약제로의 효과를 위한 살비제는 acynonapyr, fluxametamide, spirodiclofen, spiromesifen이다.

Table 2.

Information of the tested acaricides

저항성 유전자의 PCR 및 서열분석

점박이응애의 genomic DNA는 G-spin^TM Total DNA Extraction Mini Kit (Intron, Seongnam, Korea)를 사용하여 추출하였다. 100-150마리의 암컷 성충을 사용하였으며, 50-200 ng의 gDNA를 PCR에 사용하였다(AccuPower® ProFi Taq PCR PreMix, Bioneer Co., Daejeon, Korea). 저항성 관련 점 돌연변이는 GluCl1, GluCl3, cytb, CHS1, vgsc, PSST gene을 Table 3의 primer를 이용하여 반응시킨 후, sequence 분석은 Bioneer (Daejeon, Korea)와 Macrogen (Seoul, Korea)에 의뢰하여 진행하였다.

Table 3.

Primers used for PCR amplification

결 과

지역별 약제 감수성 평가

CG, GJ, HS, SJ, OC, PT1, PT2 등 7개 지역에서 채집된 점박이응애 알에 대하여 etoxazole, fenpropathrin, pyflubumide, pyridaben 추천농도에서 약제 감수성을 평가하였다(Table 4). Etoxazole과 fenpropathrin의 경우 모든 집단의 알이 10% 미만의 살란율을 보였고, pyflubumide와 pyridaben의 경우 모든 집단의 알이 각각 30%, 20% 미만의 살란율을 보였다. 7개 지역 점박이응애 알에 대하여 4 약제(etoxazole, fenpropathrin, pyflubumide, pyridaben)의 평균 살란율은 각각 4.1, 3.0, 11.1, 6.1%로 나타났다.

Table 4.

Susceptibility to acaricides in the 7 populations of T. urticae eggs

CG, GJ, HS, SJ, OC, PT1, PT2 등 7개 지역에서 채집된 점박이응애 암컷 성충에 대하여 abamectin, bifenazate, fenpropathrin, pyflubumide 추천농도에서 약제 감수성을 평하가였다(Table 5). 그 결과, abamectin의 경우 CG와 PT1 집단의 암컷 성충이 10% 미만, 나머지 집단은 20-50%의 살비율을 보였다. Bifenazate의 경우 OC, PT1, PT2 집단의 암컷 성충에서 10% 이하, CG와 GJ 집단이 30%대, SJ와 HS 집단이 각각 50%와 70%의 살비율을 보였다. Fenpyroximate의 경우 모든 집단의 성충이 60% 미만의 살비율을 보였다. Pyflubumide의 경우 성충 모두 30% 미만의 살비율을 보였다. 7개 지역 점박이응애 암컷 성충에 대하여 4 약제(abamectin, bifenazate, fenpropathrin, pyflubumide)의 평균 살비율 대비각 집단 살비율의 최소/최대는 abamectin은 PT(0.1)/HS(1.9), bifenazate는 OC(0.2)/HS(3.4), fenpyroximate는 PT2(0.3)/SJ(2.0), pyflubumide는 PT1(0.2)/CG(1.8)이였다.

Table 5.

Susceptibility to acaricides in the 7 populations of T. urticae female adults

저항성 점 돌연변이 확인

모든 야외 채집 점박이응애 집단에 대해 sequencing을 통한 저항성 점 돌연변이 발생여부를 확인하였다(Table 6). 그 결과, 대조군으로 사용한 감수성 계통(S)은 점 돌연변이가 확인되지 않았다. Abamectin 저항성 관련 점 돌연변이 G314D와 G326E는 PT1과 PT2 집단에서 확인되었다. Bifenazate 저항성 관련 점 돌연변이 G126S는 CG, GJ, OC, PT1과 PT2 집단에서 확인되었다. Etoxazole 저항성 관련 점 돌연변이 I1017F는 모든 집단에서 확인되었다. Fenpropathrin 저항성 관련 점 돌연변이L1024V와 A1215D 중, L1024V는 모든 집단에서 나타나지 않았고 A1215D의 경우 HS 집단에서만 확인되었다. Pyflubumide 저항성 관련 점 돌연변이 I260V는 모든 집단에서 확인되지 않았고, pyridaben 저항성 관련 점 돌연변이 H92R은 모든 집단에서 확인되었다.

Table 6.

Genotypes of point mutation in T. urticae

살비효과가 우수한 약제 선발

7개 지역(CG, GJ, HS, SJ, OC, PT1, PT2)에서 채집한 야외 집단 점박이응애 방제에 효과 있는 약제를 찾기 위해 acynonapyr, fluxametamide, spirodiclofen 그리고 spiromesifen을 추천농도로 처리하였다(Table 7). 그 결과 알에서는 acynonapyr의 경우 집단간 평균 97.6%의 살란율을 보였으며, fluxametamide의 경우 집단간 평균 95.7%의 살란율을 보였다. Spirodiclofen과 spiromesifen의 경우 집단간 평균 78.4%와 68.8%의 살란율을 나타내었다. 암컷 성충에 대한 살비율은 acynonapyr의 경우 집단간 평균 73.0%의 효과를 나타냈으며, fluxametamide는 모든 집단에서 100%의 높은 효과를 보였다. 하지만, Spirodiclofen과 spiromesifen의 경우, 집단간 평균 19.6%와 30.1%로 낮은 효과를 보였다.

Table 7.

Susceptibility to 4 acaricides in the 7 populations of T. urticae eggs and adults

고 찰

국내 7개 지역에서 채집한 점박이응애 야외 집단에 대해 시판중인 살비제의 생물검정 결과, 성충에 대한 약제 4개(abamectin, bifenazate, fenpyroximate, pyflubumide) 중, pyflubumide를 제외한 세 약제는 대체로 살비율이 큰 폭으로 차이를 보였으며, pyflubumide는 알에 관련한 약제 4개(etoxazole, fenpropathrin, pyflubumide, pyridaben)와 마찬가지로 모든 집단에서 살비율이 30% 미만으로 나타났다. PT1과 PT2 집단이 모든 약제에서 30% 미만의 살비율을 보여 복합 저항성을 가장 많이 가지고 있을 것으로 판단된다.

그러나 작용점 돌연변이와 함께 비교해 보았을 때, abamectin의 경우 각각 3.4%와 20.0%의 살비율을 보인 PT1과 PT2 집단에서만 GluCl1 유전자의 점 돌연변이 G314D와 GluCl3 유전자의 G326E가 발생했다. 다만 CG 집단의 경우 살비율이 PT2 집단보다 높았지만 점 돌연변이는 확인되지 않았다. 이는 최근 여러 나라의 점박이응애 연구와 비슷한 결과로, 터키의 abamectin 저항성 집단은 점 돌연변이 G314D가 아예 발견되지 않아 무독화 효소가 주 기작일 가능성이 제시되었다(Solmaz et al., 2020). 또한 유럽의 여러 abamectin 저항성 집단에서도 점 돌연변이 G314D와 G326E는 나타나지 않으며 대신 무독화 효소인 P450 monooxygenase 및 UGT가 관여한다는 것이 발견되었고(Xue et al., 2020), 중국에서는 무독화 효소 P450 monooxygenase의 유전자 CYP389C10, CYP392D8, CYP392A11 및 CYP392A12의 과발현이 abamectin 저항성과 관련된 것을 확인하였다(Xu et al., 2020). 따라서 본 실험의 결과 또한 abamectin의 저항성 기작에 무독화 효소가 관여하고 있음을 유추할 수 있었다. Bifenazate의 경우, 비교적 높은 살비율인 70%와 50%를 보인 HS와 SJ 집단에서 cytb 유전자의 점 돌연변이 G126S가 발생하지 않았으나, 3-40%의 살비율을 보인 다른 5개의 집단에서는 점 돌연변이 G126S가 발생했다. Etoxazole의 경우 모든 집단의 살란율이 10% 미만이며 모든 집단에서 점 돌연변이 I1017F가 발생함으로써 저항성 수준과 점 돌연변이 간의 일치하는 결과를 보였다. Fenpropathrin의 경우 살란율이 모두 10% 미만으로 확인되었으며, 주 기작으로 알려진 vgsc 유전자의 작용점 돌연변이 L1024V는 모든 집단에서 발생하지 않았고, A1215D는 4.8%의 살란율을 보인 HS 집단에서 발생하였다. 더 낮은 살비율로 저항성을 보인 CG, GJ, SJ, PT1, PT2 집단에서는 발생하지 않았으며 이는 저항성 수준과 점 돌연변이 간의 결과가 일치하지 않는다고 판단되었다. Pyflubumide의 경우 모든 집단에서 살란율과 살비율이 30% 미만으로 낮았음에도 불구하고 cytb 유전자의 점 돌연변이 I260V가 발생하지 않았다. Pyridaben의 경우 모든 집단에서 PSST 유전자의 점 돌연변이 H92R이 발생하였다. 다만 16.6%의 가장 높은 살비율을 보인 HS 집단의 Genotype이 RS로 확인되었다. 따라서 저항성 수준과 점 돌연변이 간의 일치하는 결과를 보였다. 결론적으로 국내 7개 집단에서 생물검정을 통한 살란율 및 살비율과 작용점 돌연변이 간의 상관관계는 bifenazate, etoxazole, pyridaben에서 확인할 수 있었으며, 이 중 etoxazole, pyridaben의 상관관계는 최근 국내에서 보고된 결과와 일치하였다(Koo et al., 2021). 이외의 약제인 abamectin, fenpropathrin, pyflubumide은 저항성의 분자적 진단 마커로 점 돌연변이를 활용하기에는 무리가 있어 추가적으로 무독화 효소의 활성과 발현량을 확인해보아야 할 것으로 판단되었다.

이러한 저항성을 지닌 국내 점박이응애 집단에 우수한 효과를 보인 약제로 알에 효과가 있는 acynonapyr와 알과 성충에서 모두 효과를 보인 fluxametamide이다. Acynonapyr의 경우 OC 집단 (86%)과 PT2 집단 (96%)을 제외한 모든 집단에서 100%의 살란율을 보였으며, fluxametamide의 경우 PT2 집단(69%)을 제외한 모든 집단에서 100%의 살란율을 보였다. 성충의 경우 모든 집단에서 100%의 살비율을 보였다. Acynonapyr는 Nippon Soda Co., Ltd.에서 새로 발견한 Tetranychus 속 및 Panonychus 속의 특정 응애류에 효과적인 살비제이며(Hamamoto et al., 2011), 아직 작용기작이 밝혀지지 않았으나 glutamate 수용체를 억제하여 신경전달 교란을 일으키는 것으로 추정된다(Kawaguchi, 2019). Fluxametamide는 Nissan Chemical Industries, Ltd.에서 발견된 새로운 isoxazoline계 살비 및 살충제로 진드기아강, 나비목, 총채벌레목 및 파리목 같은 다양한 종에 대해 높은 살충 활성을 나타낸다(Kagami et al., 2017). 알로스테릭 조절을 통해 GABA-gated chloride channel을 억제하여 흥분 및 경련을 유발하는 기작을 가졌으며 절지동물문에 대한 높은 표적부위 선택성을 지님으로써 안전성을 가진 약제이기도 하다(IRAC, 2021; Asahi et al., 2018). 이러한 두 약제는 이미 저항성 수준이 높아진 점박이응애의 방제에 효과적으로 사용이 가능할 것으로 보인다.

결론적으로, 국내에 분포하는 야외 집단 점박이응애는 많은 살비제에 대해 저항성을 가진 것을 확인하였고, 이에 대한 대책으로 acynonapyr와 fluxametamide가 점박이응애의 알 및 성충에 효과가 있을 것으로 판단된다. 따라서 포장에서의 약제 처리 시 저항성 발달 여부 확인 후 저항성이 발달된 약제나 비슷한 작용기작을 지닌 약제를 처리하는 것은 피하며, 효과 있는 약제를 교호살포 해야 한다. 살비제 저항성 발달 여부가 작용점 돌연변이와 완전히 일치하지 않는다는 것을 통해 현재까지 밝혀지지 않은 또 다른 저항성 기작이 존재하고 이를 통해 새로운 저항성 진단 마커의 개발이 필요하다고 판단된다.

이해상충관계

저자는 이해상충관계가 없음을 선언합니다.

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