다양한 작물에서 잿빛곰팡이병을 일으키는 Botrytis cinerea의 SDHI 살균제에 대한 저항성

서 론

Botrytis cinerea에 의해 발생하는 잿빛곰팡이병은 경제적으로 중요한 작물인 채소, 과일, 화훼의 수확 전과 후에 발생하여 경제적인 손실을 주는 원예작물의 중요한 병이다(Jarvis et al., 1977). 잿빛곰팡이병은 작물 초관부의 건조 기간을 증가시키거나 전염원의 밀도를 감소시킬 수 있는 경종적 방법을 사용하여 방제가 가능하지만, 작물 재배 현장에서는 여전히 신속하고 우수한 효과를 보이는 살균제를 이용하는 방법이 일반적으로 사용되고 있다. 그런데 B. cinerea는 다주기성 병환을 구성하는 생활사와 많은 포자를 생산하는 병원균이기 때문에 살균제에 대한 저항성이 발생할 확률이 아주 높은 병원균 중 하나이다(Brent et al., 1998; Leroux et al. 2002). 따라서 B. cinerea를 살균제를 이용하여 지속적으로 방제하기 위해서는 살균제 저항성 관리가 매우 중요하다. 특히 현재 사용하고 있는 benzimidazole계 살균제, dicarboximide계 살균제, anilinopyrimidine계 살균제, strobilurin계 살균제에 대해서 병원균이 가지고 있는 살균제 작용점의 특정부위에서 돌연변이가 발생하여 쉽게 저항성이 발생하기 때문에 그 관리에 더욱 주의해야 한다(Ishii et al., 2009; Myresiotis et al., 2007). 최근에 개발된 숙신산탈수소효소활성 저해 살균제(succinate dehydrogenase inhibiting (SDHI) fungicide)는 잿빛곰팡이병균 방제용 살균제로서, 작용기작이 미토콘드리아 내막에 존재하는 complex II의 ubiquinone binding-site (Q-site)에 부착하여 전자의 전달을 저해함으로써 병원균의 세포 호흡을 억제한다. 이러한 특별한 작용점과 작용 기작으로 인하여 strobilurin계와 benzimidazole계, anilinopyrimidine계 살균제와는 교차저항성을 나타내지 않는다(Avenot et al., 2010).

SDHI 살균제 그룹 중 가장 처음으로 사용되었던 살균제는 1966년에 등록되어 담자균류에 의해서 발생하는 식물병의 방제에 사용한 carboxin이다(Mathre, 1971; Tucker and Lillich, 1974; von Schmeling and Kulka, 1966). 그 후 다양한 화학 구조를 갖는 boscalid, penthiopyrad, fluopyram 등이 신세대의 살균제로 개발되었는데, 다양한 식물병원곰팡이에 대한 활성을 가지고 있어서 다양하고 넓은 적용 범위를 갖는 것이 특징이다(Klittich, 2007; Morton and Staub, 2008; Yanase et al., 2007). 국내에서도 boscalid, fluopyram, fluxapyroxad, isopyrazam, penthiopyrad 등과 같은 SDHI 살균제가 다양한 식물병을 방제하기 위하여 사용되고 있다. SDHI 살균제는 살균제가 갖는 특별한 작용기작 때문에, 저항성 발생 위험도가 중에서 고인 살균제로 분류된다(Amiri et al., 2014; FRAC, 2017). 처음 사용되었던 SDHI 살균제는 다소 제한된 적용 범위로 인해서 저항성 발생도 제한적이었지만, boscalid가 여러 가지 식물병 방제에 도입된 이후 저항성 발생이 급증하였다(Avenot and Michailides, 2007; Avenot et al., 2012; Leroux et al., 2010; Miyamoto et al., 2010). Boscalid는 미토콘드리아 내막에 존재하는 숙신산탈수소효소(SDH)의 Q-site에 수소결합을 통해 결합하면서 잿빛곰팡이병균의 생장을 억제하는데, 이 결합 부위의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되게 되면 숙식산 탈수소 효소와 살균제의 결합력이 상실되면서 저항성 병원균이 발생하게 된다(Sierotzki and Scalliet, 2013). 이처럼 SDHI 살균제에 대한 병원균의 저항성 기작은 작용점 유전자에서 발생한 점돌연변이에 의해서 살균제가 작용점에 부착하지 못하기 때문에 발생하는 질적 저항성이다. 병원균이 살균제에 대해서 갖는 저항성이 SDHI 살균제의 경우와 같이 질적 저항성이라고 한다면 살균제의 효과가 급격하게 감소하기 때문에, 포장에서 병 방제 효과도 크게 감소하게 된다. 따라서 살균제에 대한 병원균의 저항성 반응이 질적 저항성일 경우에는 포장에서 더 적극적인 살균제 저항성 모니터링과 관리가 필요하다(Deising et al., 2008).

본 연구에서는 2011년, 2015년 그리고 2016년에 다양한 기주로부터 채집한 B. cinerea를 사용하여 boscalid, fluopyram, penthiopyrad, isopyrazam, fluxapyroxad 등과 같은 SDHI 살균제에 대한 반응을 조사하여 감수성과 저항성의 기준을 결정하고자 하였으며, 결정한 기준 기반으로 저항성 발현 여부를 조사하였다. 또한 감수성균과 저항성균을 선발하여 오이(Cucumis sativus) 떡잎을 이용한 온실 검정에서 저항성균에 대한 SDHI 살균제의 효과가 감소하는 지의 여부를 직접 검정하였다.

재료 및 방법

결과 및 고찰

2011년 균주의 저항성 모니터링

2011년 딸기, 토마토, 오이에서 분리한 B. cinerea 52균주에 대하여, 한천희석법으로 SDHI 살균제인 boscalid, fluopyram, fluxapyroxad, isopyrazam, penthiopyrad의 균사생장 억제효과를 조사하였다(Fig. 1). 병원균의 평균 EC₅₀값은 boscalid에 대해서 11.56 μg/mL, fluopyram는 4.91 μg/mL, fluxapyroxad는 1.45 μg/mL, penthiopyrad는 1.04 μg/mL, isopyrazam은 0.48 μg/mL이었다. Boscalid에서 11.56 μg/mL로 가장 높았으며, isopyrazam에서 0.48 μg/mL로 가장 낮았다(Table 1). 특히 boscalid에 대해서는 EC₅₀값의 계산이 무의미한 저항성 균주가 5균주나 검출되었는데, 본 실험에서는 EC₅₀값이 100 μg/mL가 넘어가는 균주의 EC₅₀값은 100 μg/mL로 지정하여 계산하였다. 그런데 저항성 균주로 확인된 B. cinerea 11-26, 11-27, 11-29, 11-30, 11-70은 화학 구조가 다른 SDHI 살균제인 fluopyram과 fluxapyroxad, isopyrazam, penthiopyrad 등에 대해서는 모두 감수성 반응을 보였다. 2004년부터 2013년 사이에 미국 플로리다의 딸기밭에서 분리한 100개의 잿빛곰팡이병균을 사용하여 SDHI 살균제간의 교차 저항성을 검정한 결과에서 boscalid는 fluopyram과 r값이 0.03으로 상관관계가 전혀 인정되지 않았지만, penthiopyrad와 fluxapyroxad에 대해서는 0.480과 0.529의 높은 상관관계가 인정되었다(Amiri, et al., 2014). 또한 penthiopyrad와 fluxapyroxad간에도 r값이 0.865로 높은 상관관계가 인정되었다. 이와 같이 boscalid와 fluopyram 간의 부의 상관관계는 B. cinerea뿐만 아니라 오이에서 분리한 Corynespora cassiicola에서도 찾아볼 수 있다(Ishii et al., 2011). Boscalid에 대해서 고 저항성을 보이는 C. cassiicola는 penthiopyrad를 첨가한 YBA 배지에서도 전혀 균사생장이 억제되지 않았던 반면에, fluopyram을 첨가한 배지 상에서는 균사 생장이 강하게 억제되었다. 이런 결과는 Corynespora 점무늬병과 흰가루병에 대한 오이 유묘 검정에서도 boscalid에 저항성인 C. cassiicola와 Podosphaera xanthii를 접종하였을 때, boscalid와 penthiopyrad는 전혀 방제 효과를 보이지 않았던 반면에, fluopyram은 매우 우수한 방제효과를 보이며, 교차저항성이 전혀 인정되지 않았다. 그런데 본 연구 결과에서는 boscalid 저항성 균주가 fluopyram뿐만 아니라 다른 어떤 SDHI 살균제에 대해서도 교차저항성이 인정되지 않는 결과를 보여주었다. 이런 결과는 SDHI 살균제의 작용기작이 동일함에도 불구하고 살균제의 화학 구조와 대상 병원균에 따라서 살균제 저항성이 다르게 나타나며, 저항성을 유도하는 작용점 유전자의 점돌연변이 종류에 따라서도 저항성 반응이 다르기 때문에 나타난다(Ishii et al., 2010; Scalliet et al., 2012).

Fig. 1.

Inhibitory effect of fungicides inhibiting succinate dehydrogenase on the mycelial growth of Botrytis cinerea. The fungicides used in this study were boscalid (A), fluopyram (B), penthiopyrad (C), isopyrazam (D) and fluxapyroxad (E). Each fungicide was amended on PDA by an indicated concentrations. After incubating at 20oC for three days, it was measured the diameter of colony. All isolates of Botrytis cinerea were collected in 2011.

Table 1.

EC50 value of Botrytis cinerea to each fungicide inhibiting succinate dehydrogenase

SDHI 살균제에 대한 잿빛곰팡이병균의 감수성과 저항성 기준 설정 및 2015년과 2016년 균주의 저항성 모니터링

Fig. 2에서 보는 것과 같이 2015년과 2016년에 채집한 잿빛곰팡이병균은 2011년 균주와는 다르게, 실험에 사용한 5종의 SDHI 살균제 모두에 대해서 저항성을 나타내는 균주들이 나타났다. EC₅₀값의 분포도를 보아도 2015년과 2016년에 채집한 B. cinerea 균주 중에는 boscalid 뿐만 아니라, fluopyram, fluxapyroxad, isopyrazam, penthiopyrad의 균사생장 억제 효과가 감소하는 균주가 보이기 시작하였다(Fig. 3). 본 실험에서 얻은 EC₅₀값의 결과를 가지고 B. cinerea의 저항성 기준을 결정하였다. Isopyrazam을 제외한 4종의 SDHI 살균제의 경우, EC₅₀값이 20 μg/mL 미만인 균주를 감수성, 20 μg/mL 이상 100 μg/mL 미만인 균주를 중저항성, 100 μg/mL 이상인 균주를 고 저항성으로 구분하였다. Isopyrazam은 2 μg/mL 미만인 균주, 2 μg/mL 이상이고 10 μg/mL 미만인 균주, 10 μg/mL 이상인 균주 등으로 구분하여 각각을 감수성, 중저항성, 고 저항성으로 구분하였다. Boscalid에 대한 EC₅₀값이 100 μg/mL 이상인 고 저항성 균주는 2011년, 2015년, 2016년에 계속적으로 증가하였을 뿐만 아니라, boscalid를 제외한 4종의 살균제에 대한 EC₅₀값이 100 μg/mL 이상인 균주가 2015년에는 fluopyram과 fluxapyroxad에서만 각각 1균주와 2균주가 분리되다가, 2016년에는 모든 살균제에서 분리되기 시작하였다. 병원균의 분리 연도에 따라서 저항성균의 발생율이 변화하는 것은 SDHI 살균제가 등록되어 포장에서 사용되기 시작했을 때부터의 사용 기간과 관계가 깊은 것으로 생각한다. 저항성균의 분리 빈도가 가장 높았던 boscalid는 2003년부터 국내에 등록되어 사용되기 시작하였으며, fluopyram과 penthiopyrad는 2011년부터 등록되어 사용되었다. 사용 기간이 가장 길었던 boscalid는 2011년 이미 고도 저항성인 균주가 5균주 검출되었으며, 고도 저항성 균주의 분리 빈도가 2015년과 2016년에는 10.5%와 33.6%로 증가하면서 균주의 수도 4개와 36개로 증가하였다(Table 2). 2011년 균주에서는 저항성 균주가 전혀 분리되지 않았던 나머지 SDHI 살균제에 대해서도 2015년 균주부터는 중 저항성과 고 저항성을 보이는 균주가 분리되기 시작하였다. 특히 2016년에 분리한 병원균 중에서는 고 저항성 분리 빈도가 23.4%와 26.9%로 boscalid 다음으로 높았던 fluopyram과 fluxapyroxad의 고 저항성 균주는 각각 25균주와 29균주가 분리되었으며, penthiopyrad와 isopyrazam에 대한 고 저항성 균주도 4개와 1개가 분리되었다. 그런데, penthiopyrad와 isopyrazam에 대한 중저항성 균주는 19.6%와 23.4%가 분리되어, 15.0%, 16.8%, 9.3%가 분리된 boscalid, fluopyram, fluxapyroxad보다 높은 분리 빈도를 보였다.

Fig. 2.

Inhibitory effect of fungicides inhibiting succinate dehydrogenase on the mycelial growth of Botrytis cinerea. The fungicides used in this study were boscalid (A), fluopyram (B), penthiopyrad (C), isopyrazam (D) and fluxapyroxad (E). Each fungicide was amended on PDA by an indicated concentrations. After incubating at 20oC for three days, it was measured the diameter of colony. All isolates of Botrytis cinerea were collected in 2015 and 2016.

Fig. 3.

Distribution of EC50 values of Botrytis cinerea to boscalid (A), fluopyram (B), penthiopyrad (C), isopyrazam (D) and fluxapyroxad (E).

Table 2.

Isolation frequency (%) of Botrytis cinerea sensitive, moderately resistant and highly resistant to fungicides in 2011, 2015 and 2016

오이 떡잎에서 boscalid의 병 방제효과 검정

Boscalid 저항성 균주인 11-26, 11-27, 11-29, 11-30 등 4균주와 감수성 균주 11-10, 11-91, 11-94, T3-3 등 4균주를 선발하여 오이 떡잎에서 boscalid의 병 방제 효과를 직접 조사하였다(Fig. 4와 5). 균사 접종의 경우 무처리구에서 병반의 크기는 감수성 균주인 11-10, 11-91, 11-94, T3-3은 20.5, 15.6, 13.0, 15.7 mm이었으며, 저항성 균주인 11-26, 11-27, 11-29, 11-30은 17.8, 20.1, 19.5, 14.6 mm이었다(Fig. 4B와 4C). Boscalid를 100 μg/mL를 처리한 경우, 감수성 균주(11-10, 11-91, 11-94, T3-3)에 대한 병 방제 효과는 94.1, 69.2, 86.7, 100%이었지만, 저항성 균주(11-26, 11-27, 11-29, 11-30)에 대해서는 그 효과가 크게 감소하여 14.3, 46.2, 24.4, 32.6%까지 저하하였다(Fig. 4A). Boscalid의 10 μg/mL 처리구에서도 4개의 감수성 균주에 대한 평균 방제 효과는 62.4%이었으나, 저항성 균주에 대한 평균 방제 효과는 13.5%로 매우 저조하였다. 병원균의 포자를 사용하여 접종한 경우, boscalid를 처리하지 않은 무처리 떡잎에서 감수성인 4개 균주의 평균 병반 크기는 22.0 ± 7.0 mm이었으며, 저항성 균주의 평균 병반 크기는 21.1 ± 5.2 mm이었다. Boscalid의 100 μg/mL 처리구에서 감수성 균주에 대한 평균 방제효과는 100%이었으며, 10 μg/mL 처리구에서는 93.2 ± 9.0%이었으나, 저항성 균주의 경우에는 100 μg/mL 처리구에서 80.8 ± 15.4%, 10 μg/mL 처리구에서 17.3 ± 14.7%이었다. SDHI 살균제는 B. cinerea에 대해서 균사생장 억제효과 보다는 포자발아 억제효과와 발아관 신장 억제효과가 더 우수한 살균제로 알려져 있다(Song et al., 2016; Veloukas and Karaoglanidis, 2012). SDHI 살균제가 갖는 이러한 특성은 오이 떡잎 검정에서도 동일하게 나타났는데, Fig. 4와 5에서 보여주는 것처럼 균사로 접종하였을 때보다는 포자로 접종하였을 때 boscalid의 효과가 우수한 것을 보면, 균사생장 억제보다는 포자 발아와 발아관 신장 억제 효과가 우수함을 보여주고 있다. 또한 boscalid 저항성인 B. cinerea는 유묘를 이용한 식물체 상에서의 검정에서도 살균제의 방제효과가 감소함을 보여주었다. 오이 떡잎 검정의 결과는 포장 상태에서 SDHI 살균제 저항성 잿빛곰팡이병균에 대한 방제 효과가 감소하는 것을 보여주는 결과라고 생각한다. 그런데 2016년 실험에 사용한 균주 중 17.7%가 고도 저항성균으로 검정된 것을 보면 SDHI 살균제 사용과 저항성 관리에 더 세밀한 전략이 필요할 것으로 보인다.

Fig. 4.

Control effect (%) of boscalid on cucumber gray mold caused by Botrytis cinerea on the cotyledons. Botrytis cinerea was inoculated with mycelial disc, which was cut off from the tip of colony incubated at 20oC for 4 days. (A); controlling activity of boscalid on the cucumber gray mold according to its concentration, (B); controlling activity of boscalid on cucumber gray mold (pathogen; B. cinerea 11-10 sensitive to the fungicide) on cucumber cotyledon, (C); controlling activity of boscalid on cucumber gray mold (pathogen; B. cinerea 11-26 resistant to the fungicide) on cucumber cotyledon.

Fig. 5.

Control effect (%) of boscalid on cucumber gray mold caused by Botrytis cinerea on the cotyledons. For inoculation of the pathogen, B. cinerea was incubated at 20oC for 5 days, subseqeuntly incubated for 2 days with 12 hrs-irradiation of fluorescent light. After harvesting spores with BP broth, the spore density of the suspension was adjusted to 1 × 105 conidia/mL. (A); Controlling activity of boscalid on the cucumber gray mold according to its concentration, (B); Controlling activity of boscalid on cucumber cotyledon against B. cinerea 11-10 sensitive to the fungicide, (C); Controlling activity of boscalid against B. cinerea 11-26 resistant to the fungicide.

Acknowledgments

이 논문은 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단 국가생명연구자원 선진화사업의 지원을 받아 수행된 연구입니다(No. 2021M3H9A1081268).

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