Xanthomonas campestris pv. campestris에 대한 Bacillus sp. B19-108의 저해효과

균주 분리 및 배양

항균활성 측정을 위해 이용된 미생물은 내장산(전북 정읍시)에서 채취해 온 토양에서 분리한 미생물을 사용하였다. 미생물 분리를 위해 토양 1 g은 0.85% NaCl 9 mL에 넣고 연속희석법을 이용해 희석하고, 각각의 희석된 시료는 LB agar배지(DB Difco, France)에 도말하여 37^oC에서 배양하였다. 48시간 후, LB agar 배지에서 형태적으로 바실러스의 특성을 보이는 균주들을 1차적으로 선별하여 순수하게 분리하였다. 분리된 균주들은 LB broth 배지에서 48시간 진탕 배양한 후(37^oC, 160 rpm) 항균 활성 검증을 위해 배양액과 균주 모두를 사용하였다. 실험에 사용한 균주의 보존은 20% glycerol에 현탁하여 -80^oC 냉동고에 보관하면서 사용하였다.

항균활성 측정(Agar well diffusion assay)

본 실험에 사용된 검은썩음병 병원균은 농진청으로부터 분양받은 Xanthomonas campestris PV. campestris KACC10377 균주를 사용하였다. 균주는 20% glycerol medium을 사용하여 -80^oC에서 저장, 보관하였다. 순수하게 분리된 미생물들의 항균활성은 agar-well diffusion assay를 사용하여 분석하였다(Owen & Palombo, 2007). 검은썩음병 병원균인 Xcc의 배양액 100 μL을 Nutrient agar (NA, Difco, MI, USA) plate에 넣은 후 멸균된 spreader로 표면에 균질하게 도말한 후, 멸균된 tip (6-8 mm diameter)을 사용하여 agar표면에 well을 만들었다. 각각의 well에 분리된 균주들의 배양액을 100 μL을 각각 가하고, agar내로 배양액들이 확산되도록 상온에서 1-2시간 방치하였다. 각각의 plate는 30^oC에서 48시간 동안 배양하였으며, agar well 주위로 Xcc KACC10377 균주의 생장이 저해되는 clear zone의 크기(mm)를 측정하여 항균력의 크기를 계산하였다(Fazeli et al., 2007). 미생물이 접종되지 않은 LB broth 액체 배지를 음성 대조군으로 사용하였다.

효소활성측정

분리된 균주의 효소활성 유무를 확인하기 위하여 protease, amylase 및 cellulase 활성을 평가하였다. Protease 활성은 1% skim milk (Difco, USA)를 첨가한 LB agar 배지 표면에 well을 만들고, 각 well에 분리된 각 균주 배양액을 100 μL씩 분주하여 30^oC에서 48시간 반응하여 분해능을 억제환의 직경으로 조사하였다. Amylase 활성 확인은 starch agar(0.3% beef extract, 1% soluble starch, 1.2% agar) 배지(Difco, USA)의 각 well에 분리된 각 균주 배양액을 100 μL씩 분주하여 30^oC에서 48시간 배양한 뒤 lugol solution(Sigma, Swizerland)으로 염색하고 분해능을 억제환의 직경으로 조사하였다. Cellulase 활성 확인을 위하여 1% CMC가 포함된 LB agar 배지 표면에 well을 만들고, 각 well에 분리된 각 균주 배양액을 100 μL씩 분주하여 30^oC에서 48시간 배양 후 0.1% congo red로 30분간 염색하고, 1N NaCl로 세척한 뒤 나타난 억제환의 직경으로 조사하였다.

16S rRNA 염기서열을 이용한 균주동정

분리된 균주의 계통분류학적인 위치를 확인하기 위하여 16S ribosomal RNA gene의 internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene과 internal transcribed spacer 2를 포함하는 염기서열을 분석하였다. 선발한 균주의 16S rRNA sequence를 “Genebank” database에 블라스트 프로그램를 이용하여 기존에 보고된 균주와 비교하여 높은 상동성을 나타내는 것을 명명하였다.

배양 조건에 따른 미생물 균수 변화 측정

10-45^oC 온도 조건 및 pH 3.0-8.0 조건에서 배양된 각각의 미생물 배양액들은 LB agar배지에 도말한 후, 37^oC에서 24시간 배양하여 균수 변화를 측정하였다. 또한, 배지 성분들(Yeast extract, 대두분, Glucose, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄·7H₂O, K₂HPO₄, KH₂PO₄, FeSO₄·H₂O, MnSO₄·H₂O)의 함량을 변화하여 배양 한 후, 각각의 변화에 다른 균수 변화를 위와 같은 방법으로 측정하였다.

포트 방제효과 검정

배추 종자는 5×10 육묘용 연결 포트(70 mL/pot, 범농사)에 원예용상토 5호(흥농, 바이오그린상토)를 넣고 포트 당 1립씩 파종하고 항온항습실에서 재배하였다. 종자가 발아한 후 일주일 동안 재배된 유묘는 1주씩 직경 9 cm와 높이 8.5 cm 플라스틱 포트에 옮겨 심은 후 2주 동안 재배하여 방제실험에 사용하였다. 최종 선별된 균주의 검은썩음병 방제효능 실험은 4주동안 항온항습실(25^oC, 상대습도 70%, day/night 12시간 간격)에서 실시하였으며, 실험 군은 Xcc 처리군(Control (+)), 균주 처리군 1(Xcc + ×1000), 균주 처리군 2(Xcc + ×500) 및 균주 처리군 3(Xcc + ×100)의 4개군이며, 그 외 대조군은 물만 처리하였다. 최종 선별된 균주 배양액은 분말상 제형(~10¹⁰ C·F·U/mL)으로 만든 후 1000배, 500배 및 100배 희석하여 Xcc 균주 배양액 접종 1주전 1회 처리하고, 2주후에 다시 한번 1회 처리하여 총 2회 처리하였다. Xcc 균주는 기존에 보고된 방법을 변형하여 처리하였다(Islam et al., 2017). 배추 잎의 끝부분은 핀셋을 사용하여 상처를 내고, 이 부분에 거즈를 붙여놓고 1/6로 희석된 Xcc 균주 배양액을 3일간격으로 3회 접종하였다. 각 포트에 물은 2~3일에 한번씩 200-300mL씩 관수 하며 30일간 키웠으며, 30일 후 Xcc 접종 부위의 증상 정도를 조사하였다.

통계분석

검은썩음병 병원균에 대한 분리된 미생물의 항균활성 및 효소활성은 Microsoft Office Excel 2016 프로그램을 사용해 분석 하였다. 모든 실험은 3회 반복 실험하였으며, 각 값은 평균값 ± 표준편차(Standard deviation, SD)로 표시하였다.

분리된 균주의 항균활성 및 효소활성 검정

내장산 토양에서 바실러스 형태를 나타내는 60종의 세균 strain을 분리하였으며, 각각 B19-53~112번으로 명명하였다. 60종 세균 strain에 대한 검은썩음병 병원균인 Xcc 균주에 대한 항균 활성 검증 결과, 12종 strain 에서 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였으며, Table 1에 정리하였다. Xcc에 대하여 B19-108의 inhibition zone은 29mm로 분리된 60종 균주들 중에서 가장 큰 항균 활성을 보였고, 그 다음으로 B19-101 (28 mm), B19-111 (27 mm), B19-112 (27 mm) 및 B19-104 (25 mm)의 4개의 strain에서 25mm 이상의 inhibition zone을 나타냈다. 또한, B19-82 (23 mm), B19-61 (22 mm) 및 B19-106 (20mm)의 inhibition zone은 20mm 이상으로 측정되었으며, 15 mm 이상의 inhibition zone을 나타내는 strain은 B19-66 (18 mm)과 B19-110 (16mm)이었다. 그리고 B19-103 (14 mm)과 B19-109 (8mm)에서는 15 mm 이하에서 inhibition zone을 나타냈다. 이 중 20mm 이상의 inhibition zone을 나타내는 8개 strain에 대하여 Xcc 균주 배양액이 도말된 plate의 well에 배양액 200, 150, 100, 50 μL를 처리한 후 inhibition zone의 크기를 측정하여 농도의존적인 항균 활성을 나타내는지 조사하였다. 측정결과, 8종의 strain은 농도의존적으로 Xcc에 대한 항균 활성을 나타냈으며(Table 2), 4종 strain (B19-101, B19-108, B19-111 및 B19-112)의 경우 100 μL 농도 처리시 생성된 inhibition zone이 다른 strain의 200 μL 농도 처리와 비교하여 유사한 크기를 나타내어 Xcc에 대한 항균 효과가 2배이상 우수할 것으로 예상되었다. 그 중 B19-101 및 B19-108는 낮은 농도(50 μL)에서도 15mm 이상의 inhibition zone을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

Table 1.

Agar diffusion susceptibility of Xanthomonas campestris PV. campestris KACC10377 to B19 strains

Table 2.

Agar diffusion susceptibility of Xanthomonas campestris PV. campestris KACC10377 to B19 strains

Table 3.

Enzyme activities of isolated B19 strains

또한, 8종 strain에 대하여 토양 부숙능과 관련된 효소들인 단백질분해효소(protease), 탄수화물분해효소(amylase) 및 셀룰로오즈분해효소(cellulose) 에 대한 효소 활성을 측정하였다. 측정결과, 8개의 strain은 셀룰로오즈분해효소에 대한 효소 활성을 나타내지 않았으며, B19-61 및 B19-66의 경우는 단백질분해효소, 탄수화물분해효소에 대해서도 효소활성을 확인할 수 없었다. 다른 6종의 strain에서는 단백질 분해효소, 탄수화물분해효소에 대해서도 우수한 효소 활성을 확인할 수 있었다.

이상의 결과를 요약하면, 60종의 세균 strain 중 Xcc에 대한 항균 활성이 우수한 8종 strain을 선별하였으며, 이 들에 대한 효소 활성 측정결과 2종(B19-61 및 B19-66)을 제외한 6종의 strain에서 우수한 효소 활성을 확인하였다. 이 중 두종 strain (B19-101, B19-108)은 다른 strain과 비교하여 낮은 농도에서도 항균 활성이 우수한 것을 확인하였으나, 다양한 배양조건에서 안정적으로 cell수를 확인할 수 있는 B19-108를 선정하여 추가적인 실험을 진행하였다. 최종적으로 선정된 B19-108에 대한 16S rRNA 염기서열을 이용하여 분석해본 결과, Bacillus와 상동성이 높은 것으로 분석되어 Bacillus sp. B19-108로 명명하였다.

배양 조건에 따른 미생물 균수 변화 측정

최적의 배양조건 확립을 위하여 최종으로 선정된 Bacillus sp. B19-108 균주에 대하여 다양한 배양조건(온도, pH, 배지조성성분)하 에서의 균수 변화를 측정하였다. 첫번째로 pH 변화가 미생물 균수에 주는 영향을 확인하기위하여 pH가 3.0~8.0으로 조절된 LB both 배지에 Bacillus sp. B19-108 접종하고 37^oC에서 48시간동안 진탕(160 rpm) 배양하였다. 각각의 조건에서 배양된 미생물 배양액들은 LB agar 배지에 도말한 후, 37^oC에서 24시간 배양하여 균수 변화를 측정한 결과, 산성인 pH 3.0~4.0 사이에서는 10²~10⁵의 균수를 확인할 수 있었다. 또한, pH 5.0~7.0에서는 ~10⁹의 균수가 측정되어 최적의 pH 조건이 약산성과 중성 사이 임을 확인할 수 있었으며, 약 염기성인 pH 8.0에서는 ~10⁸으로 균수의 감소를 확인할 수 있었다. 두번째로는 선정된 Bacillus sp. B19-108 균주에 대하여 최적의 배양 농도를 확인하기 위하여 Table 4와 같이 다양한 온도조건에서 배양한 후 균수 변화를 확인하였다. 실험결과, 10^oC의 배양 온도에서 ~10⁷으로 측정된 균수가 온도가 증가할 수록 증가하는 경향을 나타내다 36^oC 배양 온도에서 최대의 균수(~10⁹)가 측정되었으며, 이 후 배양 온도 증가에 따라 균수가 감소하는 경향을 보였다(Table 4).

Table 4.

Changes in the number of Bacillus sp. B19-108 according to temperature and pH

Bacillus sp. B19-108 균주를 배양하기 위한 최적의 조건을 확립하기 위하여 세번째로는 배지 성분들의 함량을 변화하여 배양 한 후, 각각의 변화에 다른 균수 변화를 측정하고 Table 5에 정리하였다. 측정결과, Yeast extract 0.3%, 대두분 0.3%, Glucose 1.0%, (NH₄)₂SO₄ 0.2%, MgSO₄·7H₂O 0.05%, K₂HPO₄ 0.05%, KH₂PO₄ 0.05%, FeSO₄·H₂O 0.005% 그리고 MnSO₄·H₂O가 0.005% 함유된 배지 조건에서 배양된 Bacillus sp. B19-108 균수가 최대로 측정되었다. 이와 같이 Bacillus sp. B19-108 균주는 위의 최적 배지성분이 들어있는 배지에 접종하고, pH를 약산성과 중성 사이로 조정하고, 36^oC 배양 온도에서 배양 시 최대의 균수를 확보할 수 있을 사료된다.

Table 5.

Changes in the number of Bacillus sp. B19-108 according to the composition of the medium

분리된 미생물에 대한 방제효과(포트실험)

십자화과 작물인 배추를 이용하여 항균활성이 우수한 Bacillus sp. B19-108 균주에 대한 검은썩음병 방제효과를 기존에 보고된 방법을 변형하여 진행하였다. 본 실험에서는 우선적으로 균주 배양액에 남아 있는 영양성분들에 의한 효과를 최소화하기 위하여 Bacillus sp. B19-108 균주 배양 후 cell만 동결 건조한 후, 부형제와 혼합한 분말 제형(~10¹⁰ CFU/mL)을 만들었으며, 분말 제형의 효능을 극대화 하기 위하여 검은썩음병 병원균인 Xcc 접종 1주일 전에 처리하였다. 그리고 Xcc 접종에 의한 병증의 양상을 극대화 하기 위하여 핀셋을 이용하여 상처를 낸 배추 잎 끝부분에 거즈를 붙여 병원체의 접촉 및 시간을 증가시켜 실험을 진행하였다(Fig. 1). Xcc에 의한 증상은 엽맥을 중심으로 외측으로 엷은 V자형 황색 병반 생기는 것으로 보고되고 있어, 배추잎 끝부분에 생기는 황색 병반의 발생 유무 및 범위를 확인하였다. Xcc를 접종한 5일차부터 거즈를 붙여놓은 부분부터 황색 병반의 증상이 관찰되기 시작하였으며, 14일 이후부터 황색 병반의 범위가 증가하는 양상을 확인할 수 있었다. Xcc 단독 처리군(Control (+))의 경우 배추 잎의 30~80% 범위에서 V자형 황색 병반이 관찰되었으며(n=4), 이 중 2개의 개체에서는 황색 병반이 50% 범위로 관찰되었고, 1개의 개체에서는 70% 이상의 짙은색 황색 병반을 관찰할 수 있었다(Fig. 2). Fig. 2에서 살펴볼 수 있듯이, Bacillus sp. B19-108 배양액을 이용한 분말 제형을 농도별로 희석하여 처리 시 V자형의 황색 병반이 Xcc 단독 처리군(Control (+))과 비교하여 생성 범위가 작은 것을 확인할 수 있다. 분말 제형 1000배(1 g 분말/ 1000 mL DW) 희석하여 처리한 군의 경우, Xcc 감염에 의해 배추 잎의 30~40% 범위에서 황색 병반을 관찰할 수 있었다. 또한, 500배(2 g 분말/ 1000 mL DW) 희석하여 처리한 군에서는 2개의 개체에서 30% 범위의 황색 병반이 관찰되었으며, 나머지 개체에서는 핀셋으로 상처 낸 부분에서만 증상을 확인할 수 있었다. 그리고 100배(10 g 분말/ 1000 mL DW) 희석하여 처리한 군의 경우, 1개의 개체에서 30% 범위의 황색 병반이 관찰되었으며, 나머지 개체에서는 핀셋으로 상처를 낸 부분이외에는 약한 증상을 확인할 수 있었다(Fig. 2).

Fig. 1.

Patching using tweezers in the leaves of Chinese cabbage. For the Xcc inoculation, the leaf edges were clipped with forceps and applied gauze to the clipped area.

Fig. 2.

Effect of Bacillus sp. B19-108 on the symptom of block rot disease in the leaves of Chinese cabbage inoculated by Xcc (Xanthomonas campestris PV. campestris KACC10377). A: Non-Xcc (only treated H2O), B: Control (only treated Xcc), C: group 1 [treated Xcc and 1000 fold dilution (1 g powder/ 1000 mL H2O)], D: group 2 [treated Xcc and 500 fold dilution (2 g powder/ 1000 mL H2O)], E: group 3 [treated Xcc and 100 fold dilution (10 g powder/ 1000 mL H2O)].

본 연구에서 사용된 Bacillus sp. B19-108은 in vitro 및 포트 실험 결과 검은썩음병 유발 병원 세균인 Xcc에 대한 항균활성이 우수한 것을 확인할 수 있었으며, 향후 십자화과 작물에서 검은썩음병을 예방/치료할 수 있는 새로운 생물적 방제제개발의 자원이 될 수 있을 것으로 사료된다.