몇 가지 살균제에 대한 콩균핵마름병균 Macrophomina phaseolina의 감수성 변화

서 론

Macrophomina phaseolina는 토양 전반을 하는 식물병원균으로 옥수수, 수수, 콩, 땅콩, 완두, 목화, 참깨, 해바라기 등 284개 이상의 식물을 침입하면서 경제적으로 큰 피해를 입힌다(Odvody and Dunkle, 1979; Baird and Brock, 1999; Saleh et al., 2010; Mahmoud and Budak, 2011; Kaur et al., 2012; Ijaz et al., 2013; Ibrahim and Abdel-Azeem, 2015; Marquez et al., 2021; Rai et al., 2022). M. phaseolina는 뿌리나 줄기에 형성된 소립균핵이 접종원의 역할을 하며, 토양에서 15년 이상 생존이 가능한 것으로 알려져 있다(Short et al., 1980). 소립균핵은 주로 토양 표면에 군집하지만, 표토층에서부터 0 – 20 cm 사이에도 존재하며, 30^oC 이상의 고온 및 수분 함량과 영양분이 낮은 조건에서도 생존이 가능하다(Campbell and Van der Gaag, 1993). M. phaseolina의 생장 적온이 30 – 35^oC이다보니, 기후 변화 시나리오에 의해서 고온 건조한 기후가 될 경우 문제가 더욱 심각해질 수 있는 식물병으로 예측하고 있다(Cohen et al., 2022). M. phaseolina에 의한 병은 기주식물이 극한 환경 스트레스를 받았을 때 발생하기 시작하기 때문에, 병 방제를 위한 방법이 기주식물에 영향을 미치는 환경 스트레스를 줄이는 방법에 맞추어져 실험되고 있다(Cohen et al., 2022). 콩 재배 포장에서 목화, 수수, 옥수수 등과 콩을 윤작함으로써 M. phaseolina의 포장 밀도를 감소시키는 방법도 그 하나지만(Francl et al., 1988), 이스라엘의 멜론 재배 지역에서는 멜론 재배 시기에 윤작이 가능한 작물들이 M. phaseolina의 기주식물이다 보니 방제에 한계가 있다(Cohen et al., 2022). 관수를 통하여 M. phaseolina에 의한 병 발생을 방제하고자 하였지만, 관수가 콩 뿌리에서 M. phaseolina의 정착을 낮출 수는 있었지만, 방제 효과는 적었다(Kendig et al., 2000). 온실에서 콩과 해바라기를 대상으로 관수의 M. phaseolina 병 발생 억제 시험에는 개화기까지 발병에는 영향을 미치지 않았지만, 성숙기에는 병 발생을 억제했다는 보고도 있다(Jordaan et al., 2019). 멜론의 경우 접목을 통하여 1,000 m² 당 1,398 kg이었던 수확량이 6,174 kg까지 증가하기도 하였다(Cohen et al., 2012). 그런데 위에서 설명하는 경종적인 방제 방법은 재배하는 작물과 재배 지역의 기후 등에 따라서 일반화하기가 어렵다. 그러다 보니 저항성 품종을 재배하고자 하지만, 뚜렷한 저항성을 보이는 품종이 없어, 저항성 유전자를 탐색하는 연구들도 진행되어 왔다. Mengistu 등(2011)은 149개의 콩 유전자형에 대한 저항성 검정을 실시하여 DT97-4290과 유사한 정도의 중도 저항성을 보이는 6개의 유전자형을 선발하였고, 저항성 육종에 사용하였다. Cross 등(2012)은 몇 가지 콩의 유전자형에 대한 저항성 정도를 조사한 결과, DT97-4290보다 저항성이 큰 PI 567562A를 선발하기도 하였다(Cross et al., 2012). 최근에는 양적 형질 유전자좌(quantitative trait loci, QTL) 지도를 작성하여 얻은 균핵마름병과 밀접한 연관이 있는 QTL을 이용하여 육종 과정 중에서 저항성 개체를 정확하게 선발하는데 이용하지만(da Silva et al., 2019), 아직까지 저항성 효과가 우수한 품종의 개발은 이루어지지 않았다. 작물 재배 현장에서 신속하고 용이하게 접근할 수 있는 방제 방법 중의 하나가 살균제 처리이다. 그런데 M. phaseolina를 대상으로 개발된 살균제가 없다보니, in vitro에서 병원균에 효과적인 살균제의 선발부터(Tonin et al., 2013; Chamorro et al., 2015; Parmar et al., 2017; Lokesh et al., 2020), 종자 처리, 토양 소독, 토양 관주처리와 같은 다양한 처리에 의한 방제 효과가 포장에서 검정되고 있다(Cohen et al., 2012; Chamorro et al., 2015; Reznikov et al., 2016). 국내에서도 콩에서의 피해가 보고되면서 우수한 살균제의 선발과 종자 및 토양 처리 효과에 대한 온실 검정의 결과가 보고되었다(Ko et al., 2020). 하지만 아직까지 전 세계적으로 M. phaseolina에 의한 병의 방제가 효과적이지 못하기 때문에 더 많은 연구가 필요한 상황이다.

국내에서는 농촌진흥청의 농약직권등록시험에 의해서 2021년도에 pyraclostrobin과 fludioxonil이 등록되어 방제에 사용되고 있다. 하지만, 두 종류의 살균제만 등록되어, 병 발생에 대한 관리뿐만 아니라, 살균제 저항성 병원균이 발생할 경우 관리가 어려울 수 있다. 그렇기 때문에 우수한 효과를 가진 더 많은 살균제의 선발과 포장 사용 방법, 살균제 저항성 관리 등의 연구가 필요하다. 본 연구에서는 in vitro 실험을 통하여 M. phaseolina만을 목표로 하지 않고, 콩의 생육 후반기에 고사를 유발하는 Diaporthe longicolla, Calonectria ilicicola, Fusarium oxysporum 등의 균사 생장을 억제하는 살균제를 선발하고자 하였다. 또한 살균제 저항성 문제의 관리를 위해서 병원균의 감수성 기준을 정하고, 등록 시험이 진행되기 이전의 균주 집단과 이후 균주 집단의 살균제에 대한 반응의 경시적인 변화를 조사하고자 하였다. 특히 제주도의 균핵마름병이 심하게 발생한 지역에서 M. phaseolina 균주를 채집하여, 동일한 시기에 채집한 제주도 이외 지역의 균주 집단과 살균제에 대한 감수성을 비교하였다.

재료 및 방법

실험에 사용한 살균제

고사한 콩에서 분리한 4종의 병원균에 대한 살균제의 효과를 검정하기 위하여 작용기작이 다른 29종의 살균제를 선발하여 실험에 사용하였다(Table 1). 세포 분열을 억제하는 B1, 세포 호흡을억제하는 C2, C3, C4, C5, 신호 전달을 저해하는 E2, E3, 스테롤 생합성을 저해하는 G1, G3 그룹과 다작용점을 억제하는 보호살균제(M 그룹)를 선발하여 균사생장 억제효과를 조사하였다.

Table 1.

Fungicides used in this study

연도 별로 분리한 M. phaseolina의 살균제에 대한 감수성 변화는 병원균에 대한 EC₅₀값이 0.5 μg/mL 이하인 살균제 중에서 적용 병원균의 범위가 넓은 7종의 살균제를 우선으로 선발하여 조사하였다. 선발한 7종의 살균제는 B1 그룹인 benomyl, C3 그룹인 pyraclostrobin, C5 그룹인 fluazinam, E2 그룹인 fludioxonil, G1 그룹인 metconazole, prochloraz, tebuconazole 등이었다.

Table 2.

EC50 values (μg/mL)a of fungicides against 4 kinds of pathogensb isolated from blighted soybean plants

결과 및 고찰

살균제에 대한 Macrophomina phaseolina의 연도 별 감수성 변화

병원균은 콩 균핵마름병에 대한 포장 방제 실험을 시작하여 살균제를 등록하기 이전인 2016년부터 2018년까지 채집한 병원균 그룹과 2020년 이후에 채집한 그룹으로 나누어, 7종 살균제의 균사생장 억제효과를 비교하였다(Table 3). 그 결과, 채집 시기가 달랐던 두 집단의 benomyl과 fludioxonil, 그리고 tebuconazole과 metconazole에 대한 EC₅₀값의 차이가 통계적으로 유의하였으며(P<0.01), 2020년 이후 그룹이 2018년까지 그룹과 비교하여 평균 EC₅₀값이 2배 이상 증가하였다. 작용기작이 동일한 prochloraz는 tebuconazole과 metconazole과는 다르게 시기별 집단 간에 유의차 있는 EC₅₀값의 변화가 인정되지는 않았다. 연도 별 그룹에 대한 prochloraz, pyraclostrobin, fluazinam의 EC₅₀값 변화는 통계적으로 유의하지 못하였다.

Table 3.

Fungicide sensitivitya between the Macrophomina phaseolina isolate populationb collected by 2018 and after 2020

2018년까지 채집한 M. phaseolina의 집단과 2020년 이후에 채집한 집단에 대한 EC₅₀값의 분포를 비교하였다. Benomyl의 EC₅₀값 분포는 0.5 - 0.6 μg/mL의 구간에서 2020년 이후 채집한 M. phaseolina 균주의 수가 증가하면서 2018년까지 집단에서 보여주던 단봉 분포가 쌍봉 분포의 형태로 변화하기 시작하였다(Fig. 1A). EC₅₀값이 상승한 M. phaseolina 균주의 β-tubulin 유전자를 분석한 결과, 특정 위치에서 아미노산의 치환은 발견되지 않았다(결과 미발표). Fludioxonil의 경우 살균제에 대한 병원균의 감수성이 저하하면서, EC₅₀값의 분포가 전체적으로 고농도 쪽으로 이동하여, 0.01 – 0.03 μg/mL이었던 최빈값 구간이, 2020년 이후 균주 집단에서는 0.05 – 0.07 μg/mL로 상승하였다(Fig. 1G). 에르고스테롤 생합성을 저해하는 prochloraz, tebuconazole, metconazole에서는 0.7 μg/mL 이상인 EC₅₀값을 갖는 균주의 수가 증가하며, 고농도 구간의 균주 수가 전체적으로 조금씩 증가하는 경향을 보였다(Fig. 1B, 1C와 1D). Fig. 1C에서 보면 2020년 이후 M. phaseolina 균주 중에서 tebuconazole에 대한 EC₅₀값이 1.0μg mL 이상인 균주는 5균주이었으며, 그 중 4균주는 2021년에 분리한 균주로, M. phaseolina ASH21-025와 ASH21-027은 충북 제천에서, M. phaseolina A SH21-030과 ASH21-032은 경기 화성에서 분리하였다. Tebuconazole에 대한 EC50값은 1.098, 1.232, 1.327, 1.389 μg/mL이었으며, prochloraz에 대해서는 ASH21-025와 ASH21-032가 1.211과 1.193 μg/mL, ASH21-027과 ASH21-030은 0.856과 0.775 μg/mL이었고, metconazole에 대해서는 21-025, 210-027, 21-030이 1.135, 1.346, 1.447 μg/mL, 그리고 21-032가 0.94 μg/mL이었다. Tebuconazole에 대한 감수성이 떨어진 4균주는 동일한 작용기작을 갖는 prochloraz와 metconazole에 대해서도 감수성이 저하되며 EC₅₀값이 증가하였다.

Fig. 1.

Distribution of sensitivity of two populations of Macrophomina phaseolina to several fungicides. For the two populations of pathogens, the first was the population collected from 2016 to 2018, and the other was the one collected in 2020 and 2021. Isolates were randomly collected from soybean fields across Korea. A; benomyl, B; prochloraz, C; tebuconazole, D; metconazole, E; pyraclostrobin, F; fluazinam, and G; fludioxonil.

병원균의 살균제에 대한 EC₅₀값의 분포 양상을 가지고 저항성을 질적 저항성과 양적 저항성으로 구분한다(Brent and Hollomon, 2007). 질적 저항성은 작용점 유전자의 돌연변이가 저항성 발생 기작인 살균제에서 나타나는데, 감수성과 저항성 균주의 EC₅₀값의 차이가 뚜렷하기 때문에, EC₅₀값의 분포가 쌍봉 분포를 이루게 된다. 이에 비해서 양적 저항성은 병원균의 EC₅₀값이 전체적으로 높아지면서 EC₅₀값의 분포가 고농도 쪽으로 이동하는 양상을 보이는데, ABC transporter가 살균제를 방출하거나 또는 작용점 유전자의 과다 발현 등에 의해서 저항성이 발생할 경우 나타나게 된다(Brent and Hollomon, 2007). 본 연구 결과에서도 β-tubulin 유전자의 점 돌연변이에 의해서 저항성이 나타나는 benomyl의 경우가 질적 저항성을 보이는데, 2020년 이후 균주 집단의 분포가 쌍봉 분포 형태를 보이기 시작하였다. Fludioxonil의 작용기작은 아직까지 정확하게 규명되지 않았지만, Botrytis cinerea에서 삼투압 조절 유전자인 bos1, bcsak1, BcOS4, bos5, BRRG-1의 돌연변이와 ABC(ATP-binding cassette) transporter에 의한 다중 저항성 기작으로 설명하고 있다(Vigntelli et al., 2002; Kretschmer et al., 2009; Leroch et al., 2013). Fig. 1G에서 보는 것과 같이 fludioxonil의 EC₅₀값 분포가 양적 저항성의 특징을 보이는 것 같아, ABC transporter에 의한 다중 저항성 기작이 M. phaseolina에도 작동되는 것이 아닌가 하는 생각을 갖게 한다. 하지만 fludioxonil 저항성을 정확하게 설명하기 위해서는 포장 병원균에 대한 경시적인 저항성 모니터링과 발현 기작 연구가 더 진행되어야 한다. 양적 저항성의 발현은 Fusarium graminearum에서도 보고되어 있다(Zhou et al., 2020). 이런 결과는 fludioxonil의 방제 효과가 급작스럽게 감소하지는 않겠지만, 지속적인 사용으로 농도가 높아지면, 살균제의 사용량이 증가하면서 저항성 문제가 심화될 수도 있다.

제주도 지역과 제주도 이외 지역에서 분리한 Macrophomina phaseolina 집단의 감수성 차이

2021년 9월에 제주 북부 지역에서 채집한 고사한 콩에서 M. phaseolina를 분리하여, 제주도 이외 지역에서 분리한 균주와 살균제에 대한 반응을 비교하였다. Fig. 2에서 보는 것과 같이 7종의 살균제 중에서 benomyl과 pyraclostrobin을 제외한 5종의 살균제에 대한 반응이 통계적으로 유의한 차이를 보였다(P<0.01). 제주도를 제외한 지역에서 분리한 M. phaseolina의 prochloraz, tebuconazole, metconazole에 대한 평균 EC₅₀값은 0.590 ± 0.344 μg/mL, 0.837 ± 0.375 μg/mL, 0.866 ± 0.434 μg/mL이었으나, 제주도 지역에서 분리한 M. phaseolina의 평균 EC₅₀값은 0.212 ± 0.163 μg/mL, 0.330 ± 0.160 μg/mL, 0.389 ± 0.522 μg/mL로, EC₅₀값이 2.2배 이상 차이가 났다. 각 지역의 콩 재배 포장에서 prochloraz, tebuconazole, metconazole의 정확한 사용량을 알 수 없었기 때문에, 살균제의 사용량이 병원균의 감수성 변화에 영향을 미쳤다고 이야기할 수는 없지만, 제주도 지역에서 분리한 M. phaseolina가 살균제와 접촉할 기회가 적었기 때문에, 살균제에 대한 감수성이 높았을 것으로 추정하였다. 붉은곰팡이병을 일으키는 Fusarium graminearum도 tebuconazole을 연속적으로 처리한 후 살균제에 대한 감수성이 감소하였다는 보고가 있다(Becher et al., 2010). Benomyl의 경우, 제주 지역 집단은 제주 지역 이외 집단과 감수성에 차이가 없었다. 또한 제주 이외 지역의 집단에서 높은 EC₅₀값을 보이는 균주를 선발하여 β-tubulin 유전자 염기서열을 분석한 결과, 점 돌연변이가 발생하지 않았던 점을 보면, 제주 이외 지역과 동일하게 제주 지역에서 채집한 M. phaseolina 균주는 점 돌연변이에 의한 살균제 저항성의 발생은 없었던 것으로 생각하였다. Pyraclostrobin도 Fig. 1E에서 보는 것과 같이 시기 별 두 집단 간의 감수성에 차이가 없음을 보여 줄 뿐만 아니라, 2021년에 채집한 제주 이외 지역과 제주 지역 균주 집단 간에도 감수성이 변화하지 않았다. 하지만, 정확한 저항성 모니터링을 위해서 작용점인 cyt b 유전자에 대한 분석이 필요한 상태이다. 이상의 결과에서 보면, 제주도에서 분리한 M. phaseolina 균주는 제주도 이외에서 채집한 균주에 비하여 일부 살균제에 대한 감수성이 큰 것으로 나타났다. 최근 콩 균핵마름병의 방제를 위해서 fludioxonil과 pyraclostrobin이 등록되었다. 두 살균제 중에서 fludioxonil은 Fig. 1G와 같이 제주도 이외 지역 균주 집단에서 감수성이 낮았으나, pyraclostrobin의 감수성 간에는 통계적인 유의차가 없었다. 하지만 pyraclostrobin은 특이적인 작용점을 가지며, 저항성 발현 기작도 작용점 유전자의 점 돌연변이에 의해서 나타나기 때문에, 포장에서 사용하는데 주의 깊은 관리가 필요하다. 특히 제주도처럼 살균제에 대한 노출이 적었을 것으로 예상되는 지역에서는 살균제 사용에 대한 적극적인 관리가 필요할 뿐만 아니라, 저항성 관리를 위해서 사용하는 살균제에 대한 지속적이며 정확한 모니터링이 필요하다.

Fig. 2.

Distribution of EC50 values of Macrophomina phaseolina against each fungicide. X marks mean EC50 values of all isolates of M. phaseolina tested for each fungicide. The EC50 value was obtained with the inhibitory effect on the mycelial growth of M. phaseolina investigated by the agar dilution method in the PDA medium to which the fungicide was added at a predetermined concentration.

살균제에 대한 Macrophomina phaseolina의 교차 저항성

균핵마름병의 각 살균제에 대한 감수성의 변화가 서로 관계가 있는 지를 조사하였다(Table 4).

Table 4.

Correlation analysis between each fungicide

Fig. 3.

Regression analysis between fungicides that inhibit ergosterol biosynthesis of M. phaseolina. Regression analysis between each fungicide was performed with EC50 values of 94 isolates of M. phaseolina. R2 is the coefficient of determination. Red symbols indicate four isolates as M. phaseolina 21-025, 21-027, 21-030, and 21-032, in ascending order of EC50 values for tebuconazole.

Prochloraz, tebuconazole, metconazole은 각각 0.650 이상의 아주 높은 상관관계(p<0.01)를 보이며 교차 저항성 관계에 있음을 보여 주었다. Tebuconazole에 대한 감수성이 떨어진 M. phaseolina ASH21-025, ASH21-027, ASH21-030, ASH21-032 등 네 균주는 prochloraz와 metconazole에 대해서도 감수성이 감소하였다.

또한 benomyl에 대한 병원균의 감수성과 prochloraz, tebuconazole, metaconazole에 대한 감수성 간에도 0.5 이상의 뚜렷한 상관관계를 가지며 통계적으로 유의하였다(p<0.01). Benomyl은 작용기작이 다른 살균제에 대해서도 높은 상관 관계를 보이며 교차 저항성 관계에 있음을 보여주었다. Puccinia graminis f. sp. tritici의 경우에도 작용기작이 다른 triadimefon과 carbendazim 간에 높은 상관계수를 보이며, 교차 저항성이 인정되었다(Wu et al., 2020). 작용기작이 다른 살균제 그룹 간에 교차 저항성이 인정되는 것은 저항성의 기작이 살균제 작용점 유전자에서 발생하는 점 돌연변이가 아닌 다른 기작일 가능성이 높기 때문에 포장에서 더 많은 균주를 대상으로 모니터링과 기작 연구를 진행할 필요가 있다. Benomyl은 fluazinam과 fludioxonil에 대한 감수성과도 0.235와 0.290의 약한 상관관계가 통계적으로 인정되었으나, pyraclostrobin과는 상관관계가 통계적으로 인정되지 않았다.

본 연구에서는 M. phaseolina의 방제를 위해서 우수한 균사생장 억제효과를 보이는 살균제를 선발하고자 하였다. 그런데 포장에서 채집한 고사한 콩에서는 다양한 병원균이 분리되었고, 높은 빈도로 분리된 병원균이 균핵마름병균인 M. phaseolina, 미라병균인 D. longicolla, 검은뿌리썩음병균인 C. ilicicola, 시들음병균인 F. oxysporum 등 4종이었다. 따라서 M. phaseolina를 방제하기 위해서 선발한 살균제가 다른 병원균에도 효과가 있다면, 콩이 시들어 죽는 증상을 효과적으로 방제할 수 있을 것으로 생각하였다. 다만 살균제를 병원균에 대한 균사생장 억제효과를 가지고 선발하였기 때문에, 선발한 살균제는 포장 검정을 통하여 방제 효과를 정확하게 조사하여야 한다.

본 실험의 결과를 보면 2021년에 균핵마름병 방제를 위해서 새롭게 등록한 fludioxonil에 대한 감수성이 저하되었던 반면에, pyraclostrobin에 대한 감수성에는 변화가 없었다. 국내에서 콩에는 237개 품목의 살균제가 등록되어 있다. 그중에서 fludioxonil은 콩 균핵마름병의 방제를 위해서만 20개의 품목이 한꺼번에 등록되어 사용되고 있는 상황이기 때문에, 포장에서 사용을 관리할 수 있어야 한다. Pyraclostrobin이 속한 다3 군의 살균제는 단제 122품목와 합제 17품목이 등록되어 전체 등록된 살균제의 58.6%를 차지할 정도로 많지만, 본 실험에서는 시기 별로 채집한 집단 간에 감수성 저하 양상은 나타나지 않았다. 그런데 다3군의 살균제는 균핵마름병 이외에도 노균병, 자주무늬병 점무늬병, 탄저병 등을 방제하기 위해서 등록되어 사용되고 있으며, 무인항공기 방제용으로도 사용되고 있을 정도로 사용처가 많다. 따라서 병원균의 감수성 저하 양상이 나타나지 않았다고 할지라도, pyraclostrobin이 특이적인 작용점을 지니며 저항성 발현 위험도가 높은 살균제이니 만큼, 지속적인 저항성 모니터링이 필요하다. 에르고스테롤 생합성을 저해하는 사1군 살균제는 단제 11품목, 합제는 16품목이 등록되어 탄저병과 자주무늬병의 방제에 사용되는데, 균핵마름병에는 등록되어 있지는 않다. 하지만, 사1군에 속하는 metconazole과 tebuconazole에 대한 M. phaseolina의 감수성이 떨어지고 있기 때문에 균핵마름병균 뿐만 아니라, 자주무늬병균과 탄저병균에 대한 저항성 발생 여부도 지속적으로 모니터링하여야 한다.

대부분의 살균제 저항성 검정 연구에서는 당해 연도에 채집한 병원균의 균주를 사용하거나, 연도별로 균주를 채집한다고 해도 채집하는 기간이 제한적인 경우가 대부분이다. 하지만 본 연구에서는 2016년부터 2021년까지 6년간의 기간 동안 병원균을 채집하였으며, 균핵마름병 방제용 살균제를 등록하여 사용하기 전과 후로 나누어 살균제에 대한 반응을 비교하였기 때문에, 병원균의 살균제에 대한 감수성 정도의 경시적인 변화를 관찰할 수 있었다. 이런 경시적 변화에 대한 정보는 병 방제를 위해서 살균제를 선발할 때나, 살균제 저항성 문제를 관리할 때에는 매우 유용한 역할을 할 것으로 생각한다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 공동연구사업(과제번호: PJ014956022020)의 지원에 의하여 수행되었습니다.

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