내분비장애의심농약 판별을 위한 호르몬수용체 전사활성시험법 확립

세포주 배양

본 연구에서 사용한 hERα-Hela-9903 세포주는 인체자궁유래세포로서 Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB) Cell Bank에서 유전자변형세포 수입승인 절차를 통해서 구매하였으며, 22Rv1/MMTV_GR-KO 세포주는 인체전립선유래세포로서 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 구입하였다. 세포배양배지는 hERα-Hela-9903 세포주의 경우 10% Dextran coated charcoal treated fetal bovine serum (DCC-FBS)과 60 mg/L Kanamycin이 포함된 Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM, phenol red free) 배지를 사용하였다. 22Rv1/MMTV_GR-KO 세포주의 경우 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배지를 사용하고, 안드로겐 수용체 활성분석 전에 5% FBS가 포함된 페놀레드가 포함되지 않은 RPMI1640 배지를 사용하였다. 두 배지 모두 2mM Gluta-MAX, 0.25 μg/mL Amphotericin B, 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin를 포함하였다. 각 세포는 30계대를 넘기지 않게 배양하였다.

시험 물질

본 연구는 OECD 시험법 가이드라인 TG 455 및 TG 458에 등재된 에스트로겐 및 안드로겐 수용체 전사활성시험법에 의거하여 수행하였다. 각 가이드라인에 제시된 숙련도 물질은 Table 1과 같다. 에스트로겐 수용체 전사활성시험법의 양성대조물질로는 1 nM 및 25 pM의 17β-estradiol을, 안드로겐 수용체 전사활성시험법의 양성대조물질은 10 nM 및 800 pM의 5α-dihydrotestosterone을 사용하였다. 모든 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 녹여 시험 당일에 사용하였다.

Table 1.

List of proficiency substances from STTA assay and ARTA method

에스트로겐 수용체 전사활성시험법(Stably Transfected Transactivation Assay, STTA)

에스트로겐 수용체 전사활성 작용물질시험(agonist assay)을 수행하기 위하여 10% DCC-FBS-EMEM 배지에 희석한 hERα-Hela-9903 세포 현탁액을 1 × 10⁴ cells/well가 되도록 분주하고 3시간 동안 배양하였다. 시험물질을 각각의 해당하는 well에 농도별로 처리한 후 37^oC, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 루시퍼라제 분석은 Steady-Glo® Luciferase assay system (Promega, USA)을 사용하여, 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 수행하였다. Luciferase 발광값은 발광도 측정이 가능한 마이크로플레이트리더기(Thermo Fisher Scientific, Varioskan Lux)을 사용하여 측정하였다. Luciferase 측정값은 양성대조물질(1 nM 17β-estradiol)의 발광 측정값의 평균값을 100%로 설정하여 아래의 식으로 각 시험물질의 상대 전사 활성화 배율(Relative transcriptional activity, RTA)를 계산하였다.

다음으로 에스트로겐 수용체 전사활성 길항물질시험(antagonist assay)을 수행하였다. 본 시험에서는 세포독성 측정을 위한 clear 96 well plate와 luciferase 활성 측정을 위한 white 96 well plate를 각각 준비하였다. hERα-Hela-9903 세포를 1 × 10⁴ cells/well로 분주한 후 3시간 동안 배양하였다. 시험물질을 각각의 해당하는 well에 농도별로 처리한 후 37^oC, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 세포독성시험은 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay kit (Dojindo, Japan)를 이용하여 측정하였다. Microplate spectrometer (Thermo, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율을 계산하는 수식은 아래와 같다.

Luciferase 활성 측정은 에스트로겐 수용체 전사활성 작용시험(agonist assay)과 동일하게 Steady-Glo® Luciferase assay system (Promega, USA)을 사용하였으며 luciferase 활성 값을 계산하는 수식은 아래와 같다.

안드로겐 수용체 전사활성시험법(Androgen Receptor Transactivation Assay, ARTA)

안드로겐 수용체 전사활성 작용물질시험(agonist assay)을 위해 분석 배지로 22Rv1/MMTV_GR-KO 세포현탁액을 각 well당 3×10⁴ cells/100 μL가 되도록 분주하고 37^oC, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 시험물질을 각각의 해당하는 well에 농도별로 처리한 후 37^oC, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 루시퍼라제 활성 측정을 위하여 Steady-Glo¢ç Luciferase assay system (Promega, USA)을 사용하였으며, luminometer (Thermo, USA)로 발광값을 측정하였다. 루시퍼라제 활성 측정값은 양성대조물질(10 nM 5α-dihydroxytestosterone, DHT)에 대한 백분율로 환산하여 아래의 식으로 시험물질의 상대 전사 활성화 배율(RTA)를 계산하였다.

다음으로 항안드로겐 수용체 전사활성 길항물질시험(antagonist assay)을 수행하였다. 본 시험에서는 세포독성 측정을 위한 clear 96 well plate와 luciferase 활성 측정을 위한 white 96 well plate를 각각 준비하였다. 22Rv1/MMTV_GR-KO 세포를 3x10⁴ cells/well로 분주한 후 37^oC, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 시험물질을 각각의 해당하는 well에 농도별로 처리하고 37^oC, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양한 후, 세포독성 측정을 위하여 CellTiter-Fluor^TM Cell viability assay (Promega, USA)를 사용하였다. 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 수행한 후, fluorometer(380-400 nMEX/505 nmEM)을 사용하여 형광도를 측정하였다. 측정된 형광값을 아래 수식에 대입하여 세포생존율을 구하였다.

Luciferase 활성은 Steady-Glo® Luciferase assay system(Promega, USA)을 사용하였으며, 활성 값은 아래와 같이 계산하였다.

판정기준

각 시험법에 따라 아래의 인정 요건을 충족해야 하며, 충족되지 못하면 재시험을 수행해야 한다. 에스트로겐 수용체 전사활성시험의 경우 양성대조군(1 nM 및 25 pM 17β-estradiol)의 luciferase 활성 평균값이 용매대조군의 luciferase 활성 평균값 보다 4배 이상이어야 하며, 안드로겐 수용체 전사활성시험의 경우 양성대조물질(10 nM 및 800 pM DHT)의 luciferase 활성 평균값이 용매대조군의 luciferase 활성 평균값 보다 작용물질시험(agonist assay)에서는 13배 이상, 길항물질시험(antagonist assay)에서는 10배 이상이어야한다. 상기 인정 요건을 충족하면서 2회의 반복실험 중 2회 모두 또는 3회의 반복실험 중 2회의 결과가 아래와 같으면 양성으로 판정한다. 에스트로겐 및 안드로겐 수용체 전사활성시험(agonist assay) 결과가 시험물질의 luciferase 활성이 양성대조군(1 nM 17β-estradiol 및 10 nM DHT) 보다 10% 이상이면 양성으로 판정한다. 항에스트로겐 및 항안드로겐 수용체 전사활성시험(antagonist assay)의 경우 시험물질이 양성대조군(25 pM 17β-estradiol 및 800 pM DHT) 보다 luciferase 활성이 20% (항에스트로겐 시험) ~ 30% (항안드로겐 시험) 낮게 나타나거나, 세포 생존율이 80% 이상인 경우 또는 IC₃₀값을 산출할 수 있을 때 양성으로 판정한다.

세포안정성시험

숙련도시험을 수행하기 전, 실험에 사용한 hERα-Hela-9903 및 22Rv1/MMTV_GR-KO 세포주의 호르몬 작용반응 및 길항반응을 안정적으로 유지하는지 확인하기 위하여 세포의 안전성시험을 2반복으로 수행하였다.

hERα-Hela-9903 세포안정성을 확인하기 위하여 17β-estradiol, 17α-estradiol, corticosterone, 17α-methyltestosterone (agonist assay), tamoxifen, flutamide (antagonist assay)를 처리하여 세포생존율 및 루시퍼라제 활성값을 나타내었다(Fig. 1). 그 결과, 작용물질시험에서 17β-estradiol, 17α-estradiol, 17α-methyltestosterone을 처리하였을 때 17β-estradiol 대비 상대전사활성화배율(RTA) 값이 10% 이상이므로 양성임을 확인하였다. 반면 corticosterone의 경우 RTA 값이 10% 미만으로 음성임을 확인하였다. 길항물질시험에서는 tamoxifen을 처리하였을 때 루시퍼라제 활성을 30% 이상 억제하면서 세포생존율이 80% 이상이었으므로 양성임을 확인하였다. 반면 flutamide를 처리하였을 때는 양성판정기준에 미치지 못하여 음성으로 판정하였다.

Fig. 1.

Results of the reference standards using STTA assay to determine acceptable range values: (a), (b), (c) and (d) agonist activity of STTA assay; (e) and (f) antagonist activity of STTA assay.

22Rv1/MMTV_GR-KO 세포안정성을 확인하기 위하여 5α-dihydrotestosterone, mestanolone, diethylhexyl phthalate (agonist assay), bicalutamide, bisphenol A, diethylhexyl phthalate (antagonist assay)을 처리하여 세포생존율 및 루시퍼라제 활성값을 나타내었다(Fig. 2). 그 결과, 작용물질시험에서 5α-dihydrotestosterone 및 mestanolone를 처리하였을 때 10 nM DHT 대비 RTA 값이 10% 이상이므로 양성, diethylhexyl phthalate을 처리하였을 때 RTA 값이 10% 미만이므로 음성으로 판정하였다. 길항물질시험에서는 bicalutamide 및 bisphenol A 을 처리하였을 때 루시퍼라제 활성을 30% 이상 억제하면서 세포생존율이 80% 이상이었으므로 양성임을 확인하였다. 반면 diethylhexyl phthalate를 처리하였을 때는 양성판정기준에 미치지 못하여 음성으로 판정하였다. 결과적으로, 모든 세포안정성시험에서 각 OECD 테스트가이드라인에서 물질별로 제시하는 측정값이 기준 범위 내에 포함되어 있고, 예상되는 결과반응을 정확히 판정하는 것으로 확인하였으므로, hERα-Hela-9903 및 22Rv1/MMTV_GR-KO의 세포안정성이 확보되었음을 확인하였다(Table 2-3).

Fig. 2.

Results of the reference standards using ARTA method to determine acceptable range values: (a), (b), and (c) agonist activity of ARTA method; (d), (e) and (f) antagonist activity of ARTA method.

Table 2.

Results of reference standards from STTA assay using HeLa9903 cell line

Table 3.

Results of reference standards from ARTA method using 22Rv1/MMTV_GR-KO cell line

에스트로겐 매개 반응 확인 시험

에스트로겐 수용체 전사활성 작용물질시험(agonist assay) 및 길항물질시험(antagonist assay)를 수행하기 위하여 시험당 숙련도물질 10종을 시험하였다(Table 1). 각 시험은 양성대조군(1 nM 및 25 pM 17β-estradiol)의 luciferase 활성 평균값이 용매대조군의 luciferase 활성 평균값 보다 4배 이상 발현되어 시험의 유효성 기준을 충족하였다. 작용물질시험에서는 Atrazine 및 Reserpine을 처리한 군에서는 17β-estradiol 대비 루시퍼라제 전사활성값이 10% 미만으로 음성물질로 판단하였으며, 나머지 8종의 물질에서 RTA 값이 10% 이상이므로 양성물질로 판단했다. 길항물질시험에서는 4-Hydroxytamoxifen, Raloxifene HCl 및 Tamoxifen을 처리한 군에서 양성대조군 대비 루시퍼라제 활성을 30% 이상 억제하면서 세포생존율이 80% 이상으로 측정되어 양성물질로 판단하였다. 그러나 나머지 7종의 물질에서는 양성판단기준에 도달하지 못하여 음성물질로 판단했다(Fig. 3).

Fig. 3.

Results of the proficiency using STTA assay to determine acceptable range values: (a) to (j) agonist activity of STTA assay; (k) to (t) antagonist activity of STTA assay.

종합한 결과, 시험 물질 20종에 대하여 에스트로겐 수용체 전사활성시험 결과, OECD 테스트가이드라인(TG455)에서 제시하는 PC₁₀, PC₅₀ 및 IC₅₀값이 기준 범위 내로 측정되었고, 결과 판정도 동일하게 분석되었다(Table 4).

Table 4.

Results of proficiency substances from STTA assay using HeLa9903 cell line

안드로겐 매개 반응 확인 시험

안드로겐 수용체 전사활성 작용물질시험(agonist assay) 및 길항물질시험(antagonist assay)를 수행하기 위하여 시험당 숙련도물질 8종 및 9종을 시험하였다(Table 1). 각 시험은 양성대조군(10 nM 및 800 pM DHT)의 luciferase 활성 평균값이 용매대조군의 luciferase 활성 평균값 보다 작용물질시험(agonist assay)에서는 13배 이상 발현되었으며, 길항물질시험(antagonist assay)에서는 10배 이상 발현되어 시험의 유효성 기준을 충족하였다. 작용물질시험에서는 Butyl benzyl phthalate, Di(2-ethylhexyl)phthalate 및 Bisphenol A를 처리한 군에서 DHT 대비 루시퍼라제 전사활성값이 10% 미만으로 음성물질로 판단하였으며, 나머지 5종의 물질에서 RTA 값이 10% 이상이므로 양성으로 판단했다. 길항물질시험에서는 5종의 물질(Hydroxyflutamide, Bisphenol A, Flutamide, Prochloraz 및 Vinclozolin)에서 양성대조군 대비 루시퍼라제 활성을 30% 이상 억제하면서 세포생존율이 80% 이상으로 측정되어 양성물질로 판단하였다. 그러나 나머지 4종의 물질에서는 양성판단기준에 도달하지 못하여 음성물질로 판단했다(Fig. 4).

Fig. 4.

Results of the proficiency using ARTA method to determine acceptable range values: (a) to (h) agonist activity of ARTA method; (i) to (q) antagonist activity of ARTA method.

종합한 결과, 시험물질 17종에 대하여 안드로겐 수용체 전사활성시험 결과, OECD 테스트가이드라인(TG458)에 기술된 logPC₁₀, logPC₅₀ 및 logIC₅₀값이 기준 범위 내로 측정되었고, 결과 판정도 동일하게 분석되었다(Table 5).

Table 5.

Results of proficiency substances from ARTA method using 22Rv1/MMTV_GR-KO cell line

에스트로겐, 안드로겐과 같은 스테로이드호르몬에 영향을 주는 내분비장애물질은 아만성(subchronic) 이상의 반복독성시험이나 번식독성시험에서 심각한 독성증상을 일으킬 수 있다(Hall et al., 2021). 이러한 증상의 예로, 생식 주기(Estrous cycle)의 변화, 생식기 조직병리학적 변화(위축, 과형성), 새끼의 생식기 이상(Genital abnormalities), 성성숙(질개구시간 및 포피분리) 지연, 정자 파라미터(정자 수, 운동성 등) 및 생식능의 변화 등과 같다(Amir S et al., 2021; Astapova et al., 2019; Sultan et al., 2002; Wang et al., 2009). 이러한 점들을 고려하였을 때, 등록 농약을 평가할 때 내분비계장애물질인지 여부를 판별하는 것은 매우 중요하다.

OECD 내분비시험법 자문그룹인 EDTA (Endocrine disrupters testing assessment)에서는 4가지 분류 1) 에스트로겐 매개반응 2) 안드로겐 매개반응 3) 갑상선호르몬 매개반응 4) 스테로이드합성과정에 영향을 주지 않을 경우 내분비계 장애물질이 아닌 것으로 판단한다. 본 연구에서 다루지 않은 H295R 스테로이드 합성시험법, 랫드의 자궁비대반응시험, 갑상선 수용체 결합시험 등 다양한 내분비영향을 추가적으로 확인한다면 보다 정확한 내분비독성 평가가 가능할 것으로 판단된다.

본 연구에서는 OECD TG 455 및 458에 제시하는 에스트로겐 및 안드로겐 매개반응을 확인하는 시험법을 성공적으로 구축하였다. 향후 본 연구에서 확립한 시험법을 활용하여 에스트로겐 및 안드로겐성을 갖는 농약의 독성 영향을 확인하는데 많은 도움이 될 것으로 판단되며, 보다 안전한 농약을 관리하는데 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

저자 이해상충관계

저자는 이해상충관계가 없음을 선언합니다.