HPLC-UVD를 이용한 농산물 중 Imazapyr의 공정분석법 확립

시약 및 재료

Imazapyr (Table 1) 표준품(99.4%)은 BASF (Reg. No.172267, BAS 693 H)에서 제공받아 사용하였고, acetonitrile (ACN), dichloromethane, methanol, n-hexane 등은 HPLC등급으로 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. Hydrochloric acid (HCl)와 sodium chloride (NaCl)는 Wako (Osaka, Japan)에서, acetic acid와 formic acid는 Sigma Aldrich (Buchs, Switzerland)에서 공급받아 사용하였다. 여과보조제인 celite 545와 anhydrous sodium sulfate는 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다.

Table 1.

Physicochemical property of imazapyr

농산물 시료

분석에 사용된 농산물 시료는 국내 사용기준 설정을 위한 대두(콩류)와 각 식품군의 대표 작물인 고추(과채류), 감귤(과일류), 현미(곡류), 감자(서류)를 이용하였다. 농산물 시료는 대형마트나 인터넷을 통해 무농약 농산물로 구입하고 균질화한 후 밀봉된 용기에 담아 −50^oC에 보관하였으며, 식품공전의 검체 처리방법에 따라 전처리하여 실험에 사용하였다.

표준용액 제조

Imazapyr 표준품 10.06 mg을 methanol 10 mL에 용해하여 1,000 μg/mL의 표준원액을 조제하고, 이를 methanol/0.5% acetic acid (50/50, v/v)로 희석하여 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 5.0 및 10.0 μg/mL의 표준용액을 조제하였다. 표준원액과 표준용액은 모두 갈색병에 담아 4^oC에 보관하여 실험에 사용하였다.

추출 및 액-액분배

검체를 분쇄하여 균질화한 후 10 g(콩류 및 곡류 시료는 약 1 kg을 혼합하여 표준체 420 μm를 통과하도록 분쇄한 10 g, 과일류, 채소류 및 서류 시료는 약 1 kg을 잘게 갈아 혼합한 10 g)을 정밀히 달아 균질기 용기에 넣고 과일류, 채소류 및 콩류 시료에는 60% methanol 100 mL를 가하고 곡류 및 서류 시료에는 70% methanol 100 mL를 가하여 진탕기에서 5분간 진탕하였다. 진탕한 추출물을 여과지가 깔려있는 부흐너깔때기로 celite 545 10 g을 이용해 흡인여과한 뒤 methanol 30 mL로 잔사 및 용기를 씻어내려 앞의 여액과 합하였다. 합친 여액을 40^oC 이하 수욕 상에서 감압하여 methanol을 모두 날려버린 후, 증류수 60 mL(곡류 및 서류 시료의 경우 70 mL)를 더하여 pH 미터기를 이용해 4N HCl를 가하여 pH 2.5가 되도록 하였다. 이를 500 mL 분액깔때기에 옮기고 NaCl 15 g 및 dichloromethane 50 mL를 차례로 가한 후 심하게 흔들어 층이 완전히 분리될 때까지 정치 시킨 후 dichloromethane층을 sodium sulfate에 통과시켜 감압농축플라스크에 받는 과정을 2회 반복하고, 이를 40^oC 이하의 수욕 상에서 감압농축 하였다. 지방성 검체(곡류 및 콩류)의 경우 유지성분의 제거를 위해 미리 acetonitrile로 포화시킨 n-hexane 30 mL를 건고물에 가하여 재용해 후 250mL 용량의 분액 여두에 옮기고 미리 n-hexane으로 포화시킨 acetonitrile 30 mL씩으로 2회 분배 추출하고 감압 농축하였다. 건고된 잔류물은 methanol/0.5% acetic acid(50/50, v/v)를 가하여 최종부피 5 mL가 되게 한 뒤 1 mL를 취해 syringe filter(nylon, 0.22 μm)로 여과한 후 시험용액으로 하였다. 추출 및 분배 방법을 Fig. 1에 흐름도로 간략하게 나타내었다.

Fig. 1.

Flow chart for imazapyr analysis.

기기분석

Imazapyr 분석을 위해 HPLC-UVD를 사용하여 흡광파장 260 nm로 검출하였고, 기기분석 조건은 Table 2에 나타내었다. 분석법의 신뢰성을 확보하기 위해 LC/MS를 이용하여 재확인하였으며 그 조건은 아래와 같다(Table 3).

Table 2.

HPLC-UVD operating conditions for the determination of imazapyr residue

Table 3.

LC/MS confirmative conditions for the determination of imazapyr residue

분석법 검증

확립된 분석법의 직선성(linearity), 검출한계(LOD, limit of detection), 정량한계(LOQ, limit of quantification) 및 회수율 실험을 통한 정확성(accuracy), 정밀성(precision), 재현성(repeatability)을 검증하였다. 직선성 확인을 위해 imazapyr 표준용액 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0 μg/mL에 대한 각각의 peak 면적을 이용하여 검량선을 작성하였고 검량선의 상관계수(coefficient of correlation, r²)를 구하였다. 검출한계 및 정량한계는 크로마토그램 상에서 신호 대 잡음비(S/N ratio)가 각각 3, 10 이상으로 하였다. 콩류, 채소류, 과일류, 곡류, 서류의 각 대표농산물인 대두, 고추, 감귤, 현미, 감자의 무처리 시료에 imazapyr 표준용액을 첨가한 후 분석하여 회수율 실험을 진행하였다. 회수율 실험의 처리농도는 정량한계(LOQ), 정량한계의 10배(10LOQ), 정량한계의 50배(50LOQ)해당하는 농도로 수행하였으며, 각각의 농도 및 시료에 대하여 5반복으로 수행하여 평균 및 상대표준편차(RSD, relative standard deviation)를 계산하여 분석법의 정확성과 정밀성 및 재현성을 평가하였다. 또한, 대전지방식품의약품안전청과 실험실간 검증을 실시하여 분석법의 유효성을 확인하였다.

기기선정과 기기분석 조건 확립

Imazapyr는 n-octanol/water 분배계수(Log P_ow)가 0.11인 극성 화합물로 분자내 산(H⁺)해리될 수 있는 carboxylic acid와 pyridine 및 4-oxoimidazole의 질소원자가 포함된 약산성 화합물이다. 증기압이 0.013 mPa (25^oC)인 비휘발성 물질이기 때문에 GC(Gas Chromatograph) 분석에는 어려움이 있을 것이므로 예상되어 HPLC(High Pressure Liquid Chromatograph)를 분석기기로 선정하였다. Imazapyr의 측정파장을 선택하기 위해 PDA (Photodiode array) 검출기로 210 nm에서 360 nm까지 스캔한 결과 최대흡수파장(λ_max)이 237 nm임을 확인하였다(Fig. 2). 하지만 시료추출물을 이용해 최대 흡수파장 237 nm에서 분석을 수행한 결과, 시료 중에서 함께 추출된 성분들에 의한 간섭현상이 발생하였기 때문에 peak 감도가 검출한계 수준을 만족하며 간섭물질의 영향이적은 260 nm를 측정파장으로 최종 선택하였다.

Fig. 2.

UV absorption spectrum of imazapyr.

Imazapyr는 pH에 따라 존재하는 형태가 다른데, 유기용매와 물을 혼합한 이동상에서는 imazapyr 중 카르복실기의 수소이온이 해리되어 이온상태로 존재하게 된다(Fig. 3(F)). 이온 상태의 imazapyr는 비이온 상태의 imazapyr에 비해 칼럼과 불규칙한 흡착을 일으켜 peak tailing이 발생할 수 있으므로, 이동상용매와 액-액 분배 및 감압 후 재용해 용매에 acetic acid를 첨가하여 이온으로 해리되는 것을 방지하였다(Fig. 3(E)). 칼럼으로는 비극성 화합물의 분리에 적합한 Cadenza CD-C₁₈ (4.6 mm i.d. × 150 mm, 3.0 μm, Imtakt)을 사용하였으며 imazapyr peak의 선택성을 확보하기 위해 acetonitrile과 0.5% acetic acid의 비율을 12/88 (v/v)로 결정하였다. 이때 imazapyr의 머무름 시간은 9분대로 확인하였다.

Fig. 3.

Species concentrations varies as the difference between the pH and the pKa varies: (A) AH42+, (B) AH3+, (C) AH3+, (D) AH2 (zwitter ion), (E) AH2, (F) AH− and (G) A2− (pKa1 1.65, pKa2 3.66, pKa3 12.70).

추출 및 액-액분배 조건 확립

Imazapyr의 최적 추출 용매 선정을 위해 잔류농약 분석에 일반적으로 사용되는 수용성 유기용매인 acetone, acetonitrile, methanol으로 imazapyr 및 간섭물질에 대한 추출 효율을 비교하였다. Acetone과 acetonitrile은 각각 40%, 10%의 회수율을 보였으며 methanol은 65%의 회수율을 보였다. 극성인 imazapyr의 성질 때문에 비극성을 띄는 acetone과 acetonitrile보다 methanol에서 추출 효율이 높은 것으로 판단하였고 methanol에서의 추출효율을 개선하기 위해 imazapyr의 물에 대한 높은 용해도를 감안하여 증류수와 methanol을 혼합하여 추출용액으로 사용하였다. 대두, 고추, 감귤 시료는 60% methanol로 현미, 감자 시료는 70% methanol로 imazapyr를 추출하였다. 고추, 감귤시료의 경우 60%와 70% methanol에서 추출효율이 비슷했으나 60% methanol에서 크로마토그램의 imazapyr peak 주변 간섭물질의 영향이 적었기에 이를 추출용매로 선택하였다.

추출액 중의 간섭물질을 제거하기 위해 수용액 상의 극성 추출액을 비극성 용매로 분배하는 액-액 분배를 수행하였다. 비극성 용매에 대한 imazapayr의 분배효율을 높이기 위하여 pH를 조절하여 이온이 해리되는 것을 방지하였다. Imazapyr는 세가지(pK_a1 1.65, pK_a2 3.66, pK_a3 12.70)의 산해리상수(pK_a)를 보이며, 이 중 imazapyr가 이온억압이 되는 pH1.65-3.66 중 pH 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5에 대해 회수율 결과를 비교하였다(Table 4). 대두를 이용해 각각의 pH에서의 imazapyr의 회수율을 확인하였으며 이때 가장 회수율이 높은 pH 2.5를 액-액 분배 시 pH로 선정하였다(Fig. 3(E)).

Table 4.

Effects of solvent pH on imazapyr liquid-liquid extraction efficiency

Imazapyr의 최적 분배용매 선택을 위해 n-hexane, ethyl acetate, dichloromethane를 통한 분배효율을 비교하였다. Imazapyr가 90% 이상 분배추출된 용매는 ethyl acetate와dichloromethane이었으나 ethyl acetate는 농산물 시료 중의 간섭물질이 많이 추출되어 분석의 어려움이 있었기에 분배용매는 dichloromethane으로 결정하였다. 확립된 추출 및 분배 방법은 간섭물질을 충분히 제거할 수 있어 크로마토그래피를 통한 정제는 생략하였다. 다만, 추출액 중 유지성분을 함유하고 있는 지방성 물질인 대두 및 현미의 경우 추출 시 다량의 유지성분이 동시에 추출되어 농축 후 잔여물이 남게 되기 때문에 유지 및 비극성 성분의 정제를 위해 추가로 n-hexane과 acetonitrile를 이용한 분배법을 적용하였다.

분석법 검증

본 연구에서 확립한 시료추출, 분배 및 기기분석 과정을 무농약 농산물 시료에 적용한 결과 imazapyr와 동일한 머무름 시간에 간섭물질이 존재하지 않음을 확인하였고, 이를 통해 분석법의 선택성(selectivity)을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 4.

HPLC-UVD chromatograms of imazapyr (A) standard of imazapyr 0.5, 5 mg/kg; (B) blank and recovery of soybean; (C) blank and recovery of pepper; (D) blank and recovery of mandarin; (E) blank and recovery of hulled rice and (F) blank and recovery of potato.

Imazapyr의 직선성(linearity)을 구하기 위하여 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 5.0 및 10.0 μg/mL의 표준용액을 조제 후 HPLCUVD에 주입하여 분석한 결과 상관계수(r²)가 0.99 이상으로 나타났다(Fig. 5). 확립된 기기분석법을 통한 imazapyr의 최소검출량은 1 ng이었고, 이때의 검출한계(LOD)는 0.025mg/kg이었다. 정량한계(LOQ)는 2 ng으로 0.05 mg/kg이었다. 산출된 정량한계는 분석기기의 정량한계와 시료량, 그리고 분석과정 중의 농축배율을 계상하여 산출한 것으로 잔류 농약 공정분석법으로 적합한 수준이었다.

Fig. 5.

Calibration curve of imazapyr standard solution.

분석법의 정확성(accuracy), 정밀성(precision), 재현성(repeatability)등을 평가하기 위해 각각의 농산물 무처리 시료에 imazapyr의 정량한계, 정량한계 10배, 정량한계 50배 수준인 0.05, 0.5, 2.5 mg/kg의 처리농도로 5반복 회수율 실험을 수행하였다. 평균 회수율은 콩류인 대두에서 72.1-100.0%, 곡류인 현미에서 85.6-108.0%, 과채류인 고추에서 87.8-90.7%, 과일류인 감귤에서 76.5-79.8%, 서류인 감자에서 85.6-92.0%이었고, 분석오차는 모두 10% 미만으로 잔류농약 공정분석법으로 적합할 것으로 예상되었다(Table 5). HPLCUVD를 이용하여 분석한 각 시료의 무처리 및 회수율 크로마토그램을 Fig. 4에 제시하였다.

Table 5.

Recovery results and limit of quantification (LOQ) of imazapyr from samples spiked with solution of imazapyr (n = 5)

분석법의 재현성 확인을 위해 대전지방식품의약품안전청 유해물질과와 실험실간 검증을 수행하였다. 개발한 분석법을 대전지방식품의약품안전청에 제공하고 동일한 방법으로 분석을 수행한 후 회수율 및 표준편차를 비교하였다. 대전 지방식품의약품안전청의 각 농도별 평균 회수율은 71.2-112.3%이고 표준편차는 10%로 미만으로 조사되었다. 두 실험실간 회수율 결과에 따른 평균값은 77.0-110.1%, 변이계수(CV, %) 또한 모든 처리구에서 CODEX 가이드라인(CAC/GL 40, 2003)에서 > 0.01 mg/kg, ≤ 0.1 mg/kg의 32%, > 0.1mg/kg, ≤ 1 mg/kg의 23%보다 낮아 적합한 것으로 확인되었다(Table 6).

Table 6.

Inter-laboratory validation results of analytical method for imazapyr in samples

LC/MS를 이용한 재확인

본 연구에서 확립된 분석법의 정성적 신뢰성을 확보하기 위해 재확인 실험(confirmation)을 수행하였다. Imazapyr는 분자 내에 산 해리(H⁺)될 수 있는 부분이 있어 이온화가 용이하므로 electro-spray ionization positive-ion mode (ESI⁺)를 사용하였고 이동상에 proton source로 formic acid를 첨가하여 분석에 이용하였다. 아래의 분석조건을 바탕으로 total ion chromatogram (TIC)과 mass spectrum으로 selectedion monitoring (SIM) 분석을 위한 최적 특성이온을 선정하였다. 질량이 261.3인 imazapyr 표준용액(10 μg/mL)을 일정한 속도(10 μL/min)로 질량검출기에 직접 주입한 결과 질량이 (M+H)⁺ 형태인 262 mass 값을 확인하였다. 이 때 cone voltage의 변화(10~70 V)에 따른 최적화 과정을 통해 40 V에서 imazapyr의 최대의 peak 강도가 나타남을 확인하였다. Table 3의 최적화된 분석조건으로 분석했을 때 scan mode의 결과와 single ion recording (SIR) mode 결과가 일치함을 확인하였다(Fig. 6). 최적 이온은 감도가 높으며 분자량을 직접 반영하는 262 m/z를 최적 특성이온으로 선정하였고, 이때 imazapyr의 머무름 시간은 4.0분이었다.

Fig. 6.

Full scan mass spectrum (A) and chromatogram (B) of imazapyr at 10 μg/mL.