식물병원성 곰팡이에 대한 곤충장내세균의 항균활성

시험곤충

시험곤충으로 사용한 10종은 가운데 담배장님노린재(Nesidiocoris tenuis)는 ㈜동부 팜 세레스로부터 구입하여 온도 25 ± 2^oC, 광조건 16L:8D, 상대습도 50~60%의 조건에서 보관하면서 성충을 사용하였다. 사슴벌레붙이(Odontotaenius disjunctus)는 경기도 포천 일대에서 성충을 채집하여 사용하였다. 흰개미(Reticulitermes speratus)는 2011년 6월에 계룡산 일대에서 채집하여 사육하던 국립문화재 연구소 보존과학연구실에서 분양받아 온도 25 ± 2^oC, 광조건 16L : 8D, 상대습도 50~60%의 조건에서 썩은 나무에서 사육하며 사용하였다. 톱다리개미허리노린재(Riptortus clavatus)는 대전 유성 일대에서 성충을 채집하여 사용하였다. 열점박이잎벌레(Lema decempunctata Gebler)는 충남 청양 구기자 밭에서 성충을 채집하여 온도 25 ± 2^oC, 광조건 16L : 8D, 상대습도 50~60%에서 밭에서 딴 구기자 잎을 먹이며 사육하여 사용하였다. 무당벌레(Harmonia axyridis)는 대전 유성에서 성충을 채집하여 사용하였다. 이십팔점박이무당벌레(Henosepilachna vigintioctopunctata) 는 충남 청양 구기자밭에서 채집하여 구기자잎과 토마토 잎을 먹이며 사육하여 사용하였다. 콩풍뎅이(Popillia mutans)는 충남 청양에서, 물땡땡이(Hydrophilus acuminatus)와 팔맥풍뎅이(Anomala octiescostata)는 충남 공주에서 성충을 채집하여 사용하였다.

소화기관 분리

담배장님노린재와 흰개미는 크기가 너무 작아 장을 분리할 수 없기 때문에 −20^oC에 10분간 넣어 기절시킨 후, 멸균된 해부가위로 부속지를 뗀 충체를 표면소독 하였다. 표면 소독은 1% NaClO₃에 1분간 침지한 후 70%(w/w) 에탄올에 1분 침지한 후에 충체에 남아있는 에탄올을 제거하기 위하여 멸균된 saline solution (9.32 g NaCl, 0.77 g KCL, 0.5 g CaCl₂, 0.18 g NaHCO₃, 0.01 g NaH₂PO₄/1 l pH7.4)으로 세척한 후 멸균수 200 μl가 채워진 1.5 ml eppendorf tube(Axyzen, Central Avenue Union City. USA)에 한 마리씩 넣어서 곤충마쇄봉으로 마쇄하였다.

또한, 사슴벌레붙이, 톱다리개미허리노린재, 열점박이잎벌레, 무당벌레, 이십팔점박이 무당벌레, 콩풍뎅이, 물땡땡이와 팔맥풍뎅이는 기절시킨 후 같은 방법으로 표면소독한 후멸균된 미세가위로 복부를 절개한 후 소화기관을 분리하였다. 분리된 소화기관은 멸균수 100 μl가 채워진 1.5 ml eppendorf tube에 한 마리의 소화기관을 넣어 곤충마쇄봉으로 마쇄하였다.

장내세균의 분리 및 동정

각 시험곤충들의 개체별로 분리된 소화기관과 충체를 eppendorf에 멸균수와 함께 넣고 마쇄봉으로 마쇄한 후, 적정량을 희석하여 NA배지(Difco^TM Nutrient Agar), PDA(Difco^TM Potato Dextrose Broth, Bacto^TM Agar), TSA(Bacto^TM Tryptic Soy Broth, Bacto^TM Agar)배지에 각각 배양하여 서로 다른 콜로니를 육안으로 식별하여 순수 분리하였다. 순수분리한 단일 콜로니들을 ㈜MACROGEN에 의뢰하여 16sRNA를 PCR 증폭 하였다. PCR 증폭에 사용된 primer는 518F (5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3') primer와 800R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3') primer를 사용하였다. 518 Forward primer, 1 μl; 800 Reverse primer, 1 μl; Taq polymerase(Solgent, Korea), 0.1U; dNTP, 1 μl; 10 × buffer, 3 μl; DW, 22.9를 0.2 ml PCR tube에 넣고 잘 혼합한 후 95^oC에서 5분간 반응한 다음 94^oC에서 denaturation 45초, 55^oC에서 annealing 1분, 72^oC에서 extention 1분을 35회 반복하고, 72^oC에서 10분간 final extention의 조건으로 PCR(DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (BIORAD)) 반응을 실시하였다. 정제한 16s RNA를 주형으로 BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. Sequencing PCR은 BioDye 1.3 μl, T7 primer 1 μl, 16s RNA sample 1 μl (100 ng), 2Xbuffer 3.4 μl에 멸균수 13.3 μl를 잘 혼합한 후 cycle sequencing을 실시하였다. PCR 산물은 100% ethanol 50 μl와 3M sodium actate (pH 5.2) 2 μl를 첨가한 후 22,040G에서 25분간 침전시키고, 250 μl의 70% ethanol로 세척하여 건조시킨 후 HiDi 후 Formamide 20 μl를 첨가하여 95^oC에서 2분 동안 denaturation 후 얼음 위에서 냉각시키고 ABI PRISM 3730XL Analyzer (96 capillary type)를 사용하여 16S rDNA (500~580 bp) 염기서열을 결정하였다. 염기서열은 SeqMan program을 이용하여 Alignment하여 정리하였다. 정리된 16s RNA 염기서열의 similarity는 NCBI/GeneBank database의 BLAST program을 이용하여 비교하였다.

식물병원성 곰팡이

농작물에 피해는 주는 주요 식물병원균은 7종으로 토마토 겹둥근무늬병균(Alternaria solani CNU 003591), 고추 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides CNU 134099)은 충남대학교 식물병리I실험실에서 분양받아 사용하였으며, 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 고추역병균(Phytophthora capsici), 벼문고병균(Rhizoctonia solani), 상추균핵병균(Selerotinia sclerotiorum)은 충남대학교 식물병리II 실험실에서 분양받아 사용하였다.

항균활성 측정

식물병원성 곰팡이 7균주의 선단부를 7 mm cork borer로 떼어낸 후 NA배지에서 배양된 장내세균과 2.5 cm 간격으로 PDA (Potato Dextrose Agar)배지에 접종하여 대치배양하였다. 병원균의 성장속도에 따라 5~15일간 25^oC에서 배양한 뒤 장내세균에 의한 병원균의 inhibition zone의 길이를 측정하여 다능과 같은 식으로 활성을 검정하였다.

R₁= 병원성 곰팡이의 대조구의 직경,
R₂= 항균활성을 갖는 장내세균에 의해 저해되는 곰팡이의 직경

을 이용하여 구하였다.

길항 세균 선발

곤충으로부터 분리한 장내세균과 7종의 식물병원성 곰팡이 모두가 잘 자라는 PDA배지에서 대치배양을 하였을 때, 비교적 높은 방제가를 가지며, 7종 모두의 식물병원성 곰팡이에 항균활성을 갖는 Pseudomonas aeruginosa를 선발하였으며 이는 사슴벌레붙이와 콩풍뎅이에서 동시에 분리되었다.

in vivo 분무실험

곤충의 장내세균 중 식물병원성 곰팡이에 높은 항균활성을 갖는 P. aeruginosa를 선발하여 고추에 직접 분무 처리한 다음, 고추 탄저병균 분무 후의 방제효과를 실험하였다. 먼저 병이 들지 않은 건강한 고추를 물로 세척한 후 1% 락스에 3분간 담갔다가 70% 에탄올로 표면을 소독하여 한 처리구당 고추 5개씩 준비한다. 무처리구 고추로는 아무것도 처리하지 않은 고추와 표면에 멸균수를 5 ml 스프레이로 뿌려 충분히 적신 고추를 말린다. 세균 처리구는 액체배지인 LB(Difco^TM Luria Bertani medium broth) 배지에 P. aeruginosa균을 배양한 배양여액 1 × 10⁶ cfu/ml를 고추 표면에 분무하여 충분히 뿌린 후 자연건조 하였다. 그리고 모든 처리구에 C. gloeosporioides 의 포자현탁액 1 × 10⁵ spores/ml을 5 ml씩 충분히 젖도록 분무한 후 자연건조 하였다. 플라스틱 용기에(30 × 20 × 8 cm) 담고 바닥에는 멸균된 티슈를 깔고 그위에 멸균수를 30 ml뿌려 습도를 유지하였고 25^oC에서 10일 동안 저장 한 후 발병도를 관찰하였다(Lee 등, 2003). 모든 처리구는 3반복씩 실험하였다.

in vivo 접종실험

곤충의 장내세균 중 식물병원성 곰팡이에 높은 항균활성을 갖는 균으로 선발한 P. aeruginosa를 고추에 처리한 후 고추 탄저병균을 직접 접종하여 방제효과를 실험하였다. 건강한 고추를 물로 세척한 후 1% 락스에 3분간 담갔다가 70% 에탄올로 표면을 소독하여 한 처리구당 고추 5개씩 준비한다. 아무것도 처리하지 않은 무처리구와 아무것도 배양하지 않은 액체배지인 LB배지, 시중에서 판매되고 있는 고추 탄저병 농약(성보화학- 해비치 입상수화제)과 선발된 P. aeruginosa 배양액을 1 × 10⁵ cfu/ml, 1 × 10⁶ cfu/ml 그리고 1 × 10⁷cfu/ml 모두 5 ml씩 spray한다. 모든 처리구들을 자연 건조 시킨 후, 멸균한 핀으로 고추의 위, 중간, 아래 세 구역에 핀으로 2번 찌른 후, C. gloeosporioides 의 포자현탁액 1 × 10⁵ spores/ml을 20 μl씩 직접 접종한다. 그리고 위에서의 실험과 같이 습도를 유지하고 25^oC에서 15일 동안 저장한 후 발병도를 관찰하였다(Paul, 2012). 모든 실험은 3반복씩 실험하였다.

곤충의 장내세균의 분리 및 동정

곤충과 미생물과의 관계에 대한 연구는 기주와 공생자로서의 관계뿐만 아니라 곤충장내미생물이 병원성을 일으키거나 장내미생물 자체의 역할에 대한 연구가 증가하고 있다. 최근에는 특히 곤충병원성에 한정되는 것이 아니라 곤충과 미생물을 동시에 다방면으로 연구하는 경향을 보이고 있다(Werren, 1997; Douglas, 1998). 따라서 본 연구에서는 곤충중장내 미생물에 의한 식물병원성균을 억제하는 균주를 탐색하여 미생물살균제를 개발하기 위하여 포식성이자 식식성 곤충인 담배장님노린재를 포함한 10가지 곤충의 중장내에서 분리한 장내세균이 식물병원균에 대한 항균활성을 연구하였다. 실험에 사용한 10종의 곤충은 상품화되어있는 곤충을 구입하거나 또는 야외에서 채집하여 중장을 분리하여 마쇄한 후 NA배지에 배양하였고 육안으로 식별하여 형태적으로 차이를 보이는 콜로니들을 분리하여 동정하였다. 분리한 장내세균의 16S rRNA 염기서열을 분석하여 BLAST search를 통해 동정되었다(Table 1). 그 결과 담배장님노린재에서 Cedecea속을 포함한 4균주가, 사슴벌레붙이에서 Enterobacter 속을 포함한 3균주, 흰개미에서는 Acinetobacter속을 포함한 3균주, 톱다리개미허리노린재에서 Clavibacter 속을 포함한 4균주가 분리되었고, 열점박이잎벌레에서는 Bacillus속을 포함한 11균주, 이십팔점박이무당벌레에서는 Enterococcus속을 포함한 3균주, 무당벌레에서는 Staphylococcus속 균주 2가지가, 콩풍뎅이에서는 Enterobacter asburiae 균을 포함한 5균주, 물땡땡이에서는 Aeromonas속 균을 포함한 7균주, 팔맥풍뎅이에서는 Brucella속 균을 포함한 7균주가 분리되어 10종의 곤충으로부터 총 49균주를 분리하는데 성공하였다. 이러한 균주는 농작물과 밀접한 관계를 갖고 있는 곤충으로부터 분리하였기 때문에 식물병원성 병원균과의 길항작용의 관계를 시도하였다.

Table 1.

Intestinal microorganisms obtained from adult of 10 insects

항균활성 측정

항균활성은 세균과 곰팡이 모두가 잘 자라는 PDA배지에서 7종의 식물병원성 곰팡이와 곤충의 장내세균 49균주를 각각 대치배양 하였을 때 항균효과에 의해 곰팡이가 저해되는 정도를 관찰하여 측정하였다. 그 결과 Table 2에서 볼 수있는 것 같이 49균주에서 26균주는 활성을 나타냈으나 나머지 23균주는 어느 곳에서도 효과를 보이지 않았다. 따라서 항균활성을 나타내는 균주들을 살펴보면 A. solani에 항균활성을 갖는 26균주, B. cinerea에 항균활성을 갖는 5균주, C. gloeosporioides에 항균활성을 갖는 13균주, F. oxysporum에 항균활성을 갖는 11균주, P. capsici에 항균활성을 갖는 16균주, R. solani에 항균활성을 갖는 1균주와 S. sclerotiorum에 대하여 항균활성을 갖는 1균주로 나타났다. 식물병원성 7종 모든 균주에 활성을 나타내는 것은 Pseudomonas aeruginosa 1종이었다.

Table 2.

Antifungal activity of intestinal microorganisms against plant-pathogenic fungi on the PDA

길항세균 선발

시험곤충으로 사용한 10종의 곤충으로부터 49종의 장내세균을 분리하였고 그중에서 26종의 생물효과를 나타내는 균주에서 생물효과가 우수하고 살균활성범위가 넒은 Pseudomonas aeruginosa균주를 선발하였다. 그리고 대표적인 식물병원성 곰팡이 7종을 PDA배지에서 재시험하여 대치배양한 결과, Alternaria solani에 대하여 83.8%, Botryis cinerea에 71.4%, Colletotrichum gloeosporioides에 63.3%, Fusarium oxysporum에 65.0% 그리고 Phytophthora capcisi 병원균에 대하여 75.8%의 억제효과를 나타냈다(Fig. 1). 따라서 7종의 곰팡이 모두에게 항균활성을 갖는 Pseudomonas aeruginosa균주를 생물활성을 하기 위하여 선발하였다.

Fig. 1.

Antifungal activity of Pseudomonas aeruginosa against Ⓐ A. solani, Ⓑ B. cinerea, Ⓒ C. gloeosporioides, Ⓓ F. oxysporum and Ⓔ P. capcisi on PDA (A: only fungi; B: Ps. aeruginosa and fungi dual culture)

in vivo 분무시험

항균활성이 뛰어난 Pseudomonas aeruginosa균주의 배양액으로고추탄저병에 대한 방제효과를 검토하였다(Fig. 2). 빨간 고추를 준비하여 무처리구는 증류수만 처리한 것(Fig. 2, A)과 아무것도 처리하지 않은 것(Fig. 2, B)에 그리고 생물효과를 검토 위하여 P. aerugionosa 배양액을 1 × 10⁶ cfu/ml가 되도록 건전한 고추에 살포한 것(Fig. 2, C)에 음건 후 고추탄저병균(C. gloeosporioides)이 감염되도록 배양액이 1 × 10⁵ spores/ml로 하여 처리하였다. 처리한 후 습도를 유지시켜주며 25^oC에서 10일간 배양하였다. 그 결과 무처리구와 증류수 처리한 것에서는 눈에 띄게 탄저병을 발생한 것을 관찰 할 수 있었으며 P. aeruginosa 배양액을 살포한 고추에서는 비교적 매우 적게 발생한 것을 관찰 할 수 있었다.

Fig. 2.

Control effect of Pseudomonas aeruginosa against Colletotrichum gloeosporioides on chilli at 25oC, 10 days after spray experiments. (A: treat DW, C. gloeosporioides spray, B: only C. gloeosporioides spray, C: treat Ps. aeruginosa suspension 1 × 106 cfu/ml)

in vivo 접종시험

곤충의 장내세균 중 7종의 식물병원성 곰팡이에 대하여 높은 항균활성을 갖는 P. aeruginosa균주을 선발하여 생물효과 시험을 행하였다. 먼저 각각의 시험재료를 고추에 분무 처리하고 나서 음건 후에 고추 탄저병균(C. gloeosporioides)을 고추에 직접 접종하여 방제효과를 실험하였다. Fig. 3에서 볼 수 있는 것 같이 아무것도 처리하지 않은 고추를 무처리구(A)와 순수 액체배지인 LB배양액(B) 그리고 고추탄저병농약(성보화학-해비치 입상수화제)(C)을 처리하였다. 또한 시험균주인 P. aeruginosa 배양액을 각각 농도별로 1 × 10⁵ cfu/ml(d), 1 × 10⁶ cfu/ml(e) 그리고 1 × 10⁷cfu/ml(f)가 되도록 조제하여 살포하였다. 건조된 6개의 처리구의 고추에 멸균한 핀으로 일정하게 찔러 상처를 낸 후, C. gloeosporioides균주의 각각 포자현탁액을 조제하여 20 μl씩 직접 접종 처리하였다. 습도를 유지시켜주며 25^oC에서 15일을 배양하였다. 그 결과, Fig. 3의 A의 무처리구에서는 고추탄저병의 증상이 눈에 띄는 병징을 관찰 할 수 있었으며, 영양분이 풍부한 LB배지 처리구에서는 고추탄저병의 병징 뿐 아니라 무처리구에서 발생한 병징보다 더 무름 현상을 관찰할 수 있었다. 고추탄저병에 등록된 해비치 농약을 처리한 구와 각각의 농도로 살포된 P. aeruginosa 배양액 처리구에서는 비교적 고추 탄저병의 병징이 덜 한 것을 관찰할 수 있었다. 특히 농약처리구와 P. aeruginosa 배양액 처리구는 육안으로 보았을 때 병 발생의 저해가 비슷하게 관찰되었으나 시간이 지남에 따라 농약처리구의 고추가 더 빨리 시드는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 P. aeruginosa 균주는 그람음성의 녹농균으로서 미생물살균제로서의 사용은 더 많은 분류 과학적 연구수행을 필요로 한다.

Fig. 3.

Control effect of Pseudomonas aeruginosa against Colletotrichum gloeosporioides on chilli at 25oC, 15 days after spray and spot experiments. (A: only C. gloeosporioides spot; B: treat LB media, C. gloeosporioides spot; C: treat fungicide(Haibichi), C. gloeosporioides spot; d: treat Ps. aeruginosa suspension 1 × 105 cfu/ml, C. gloeosporioides spot; e: treat Ps. aeruginosa suspension 1 × 106 cfu/ml, C. gloeosporioides spot; f: treat Ps. aeruginosa suspension 1 × 107 cfu/ml, C. gloeosporioides spot).