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MWS28(Accession No. MK208682) 균주는 생육이 우수한 포도나무 근권의 토양에서 분리하여 병원균 생장억제가 가장 우수한 균주를 선발하였다(Jin et al., 2018). MWS28 균주는 Tryptic Soy Broth (TSB; Difco, USA) 배지를 사용하여 30°C, 150 rpm 조건의 진탕 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 균체는 원심분리(8,000 rpm, 10 min)를 통해 회수하였으며, 인산완충식염수(PBS, pH 7.4)로 2회 세척하였다. 균주 현탁액의 농도는 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서의 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하여 추정하였고, 희석 평판법(dilution plating method)을 통해 최종 처리 농도를 1.0 × 10⁹ cfu/ml로 조정하여 실험에 사용하였다.

사과 갈색무늬병과 탄저병 방제효과 시험은 자연 발생하는 사과원에서 ‘후지’ 품종을 대상으로 시험하였으며, 시험구는 반복당 1주를 대상으로 3반복을 완전임의로 배치하였다(Table 1). 무처리구는 처리구의 비산을 고려하여 버퍼존을 충분히 두어 배치하였다. 또한, 시험포장은 살균제 영향을 피하기 위해 만개 후부터 수확기까지 타 살균제는 처리하지 않았고, 살충제는 사과 관행재배를 따랐다.

사과 갈색무늬병과 탄저병에 대한 방제효과를 알아보기 위해 MWS28 현탁액(1 × 10⁸ cfu/ml)을 100배 희석하여 6월 상순부터 10일 간격으로 갈색무늬병 시험구는 4회, 탄저병 시험구는 7회 처리하였다. 시험구는 MWS28 경엽처리구, MWS28 관주처리구로 구성 하였다. 두 병해에 대해 경엽처리는 주당 4L, 토양관주처리는 주당 40L 처리 하였으며, 최종약제처리일부터 10일 간격 4회씩 주당 200엽(과)에 대한 발병수를 조사하였다. 조사된 발병엽(과)수는 발병률로 환산하여 방제효과를 평가하였다.

유도저항성 평가는 앞선 갈색무늬병 방제시험과 동일한 방법으로 MWS28 현탁액(1 × 10⁹ cfu/ml)을 100배 희석하여 주당 40L씩 토양관주를 수행하였다. 약제처리시기는 매년 6월 상순 10일 간격 4회씩 처리하였고, 처리구는 단일연도(2025년), 2년 연속(2024–2025년), 3년 연속(2023–2025년) 처리구로 구성하였다. 갈색무늬병 방제효과 조사는 2025년에 실시하였으며 최종약제처리일부터 10일 간격 4회씩 주당 200엽에 대한 갈색무늬병의 발병엽률을 조사하여 MWS28의 연속 처리에 따른 유도저항성 증가 효과를 비교하였다.

건전한 사과의 신초가 포함된 가지를 채취하여 실험실 조건에서 MWS28 현탁액(1 × 10⁹ cfu/ml)을 분무기를 이용하여 살포하였고, 대조구에는 처리구와 동일한 양의 멸균수를 처리하였다. 처리 후 0, 6, 12, 24, 48, 72시간 경과 시점에서 각 처리구별로 엽을 3반복으로 채취하였다. 채취된 시료는 즉시 액체질소로 급속 동결하여, 분석 전까지 -80°C 초저온 냉동고에 보관하였다. 동결 시료는 액체질소 하에서 분쇄하여 미세분말로 만든 뒤, RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 Total RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 NanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 순도(A260/A280 ratio)와 농도를 측정하였다. 순도가 1.8−2.1 범위인 RNA 시료 1 μg을 주형으로 iScript^TM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, USA)를 사용하여 역전사 반응을 수행하였고 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)과 SsoFast^TM EvaGreen® Supermix (Bio-Rad, USA)를 이용해 특정 유전자의 발현을 정량 분석하였다. 분석 대상 유전자와 표준유전자 증폭을 위한 프라이머는 Park et al. (2023)이 제작한 프라이머를 참고하여 사용하였다(Table 2). RT-PCR 반응조건은 95°C에서 3분간 초기 변성 후, 95°C에서 10초, 60°C에서 30초를 한 주기로 하여 총 40회 반복 증폭하였다. 유전자 발현량의 상대적 정량은 내부 표준유전자인 Actin으로 보정한 후, 2^−ΔΔCt방법을 이용하여 계산하였다(Livak and Schmittgen, 2001).

모든 실험데이터는 3반복 이상의 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다. 통계분석은 SAS 9.4 (SAS Corp.,USA) 프로그램을 사용하였다. 포장시험에서 얻어진 처리구 간 발병률 및 방제가 데이터는 분산분석(ANOVA)을 실시한 후, Duncan 다중범위검정 (Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 통해 P<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다. 유전자 발현 분석 데이터는 각 시간대별 처리군과 대조군간의 발현량차이를 Student'st-test를 이용하여 P<0.05 및 P<0.01 수준에서 유의성을 분석하였다.

경엽처리를 결과, 최종약제처리 후 10일차 조사에서 갈색무늬병 6.7%, 탄저병 5.0% 발병하여 각각 67.0%, 69.1%의 방제효과를 보였으며 무처리구 대비 유의성이 나타났다(Table 3, Table 4, Fig. 1, Fig. 2). 이후 시간이 경과함에 따라 40일차에 갈색무늬병 35.8%, 탄저병 39.8%를 보였지만, 탄저병의 경우 30일차에도 52.9%의 방제효과를 유지하여 유기농업자재 효능·효과 등록 기준(무처리 대비 50% 이상)을 충족하였다. MWS28 경엽처리 시 사과의 엽이나 과실 표면에 부착되어 직접적으로 병원균에 작용하여 효과가 즉각적으로 나타났다. 이러한 결과는 겨자채 흰가루병, 포도 흰얼룩병, 감귤 저장병, 고추 탄저병에 방제 효과를 나타냈다는 보고와 일치하였다(Jin et al., 2018, Lee et al., 2012, Lee et al., 2016, Park et al., 2018). 다만 미생물기반 방제제는 온습도, 강수량, 광노출 등 환경요인의 영향을 받아 현장 적용시 약효 변동성이 존재하는 것으로 알려져 있으며(Kim, 2007; Torres-Rodriguez et al., 2022), 본 연구에서도 처리 후 시간이 경과함에 따라 방제효과가 감소하는 경향이 확인되었다.

Fig. 1.  
Control efficacy against Marssonia blotch evaluated four times at 10-day intervals.

Fig. 2.  
Control efficacy against Anthracnose evaluated four times at 10-day intervals after treatment.

MWS28 관주처리시, 최종약제처리 후 10일차 갈색무늬병 37.4%, 탄저병 40.1%로 무처리구 대비 유의성은 있었으나, 병해관리용 방제제로 사용하기에는 충분하지 않은 수준이었다. 그러나 갈색무늬병의 경우 30일차 52.8%, 40일차 59.4%의 방제효과를 보였으며, 이는 무처리구에서 발병률이 빠르게 증가한 데 비해 처리구에서는 증가폭이 낮아 상대적인 방제효과가 커진 것으로 판단된다.

MWS28의 식물병 방제 효과는 단일기작이 아닌 여러 메커니즘이 복합적으로 작용한 결과로 해석 되는데, 이는 크게 직접적 길항작용과 유도전신저항성(ISR)을 통한 간접적 방제라는 두 가지 축으로 설명할 수 있다. MWS28이 생산하는 물질을 분석한 결과 Iturin과 Surfactin이 확인되었는데, 이러한 리포펩타이드 계열 항생물질들은 곰팡이의 세포막을 파괴하거나 막 유동성을 변화시켜 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다(Tao et al., 2024). Kim et al.(2021)은 MWS28과 같은 계열의 B. velezensis AK-0 균주의 게놈분석 결과, 8개의 2차대사산물 생합성클러스터를 확인하였으며, Park et al. (2024)은 B. velezensis GYUN-1190 균주가 생산하는 휘발성 유기화합물 (VOCs)과 배양여과액이 사과 탄저병균(Colletotrichum fructicola)의 균사생장과 포자발아를 효과적으로 억제한다고 보고하였다. 또한, Rashid et al. (2017)은 B. velezensis가 biofilm 형성 및 Surfactin 생성 등을 통해 벼의 병원성 미생물에 대한 전신유도저항성을 유도한다고 하였으며, Chen et al. (2024)은 β-1,3-glucanase 등 방어 관련 효소의 활성을 촉진하고 SA 및 JA 신호 경로를 활성화하여 수박 시들음병을 발병을 억제한다고 보고한 바 있다.

본 연구 결과, MWS28은 경엽처리와 관주처리 모두에서 무처리 대비 병 발생을 유의하게 억제하였으며, 이는 MWS28이 다양한 적용방식으로 사과병해 방제에 활용될 수 있는 잠재력을 가졌음을 보여준다. 경엽처리는 병원균이 주로 침입하는 잎과 과실 표면에 직접 작용하여 즉각적인 효과를 기대할 수 있으며, 관주처리는 뿌리에 정착하여 식물 전체의 저항성을 지속적으로 유도하고 토양 내 병원균 밀도를 억제하는 장기적인 효과를 가져올 수 있다(Podile and Kishore, 2006). 이는 재배환경 및 병 발생 양상에 따라 단독 또는 병행처리 전략을 활용할 수 있을 것으로 판단된다.

MWS28의 연속 처리 효과를 확인하기 위해 단년도, 2년 연속, 3년 연속 관주처리구의 갈색무늬병 발병률을 비교하였다(Fig. 3). 최종약제처리 후 10일차 조사에서 2년 및 3년 연속 처리구의 방제효과는 단년도 처리구보다 15.4%, 13.8% 높았다. 20일차 조사에서도 단년도 처리구가 30.8%의 방제효과를 보인 반면, 2년 및 3년 연속 처리구는 51.5% 높은 방제효과를 보였다. 2년연속 처리와 3년연속 처리구간 방제가는 차이가 보이지 않았다. 이러한 결과로 보아 MWS28이 일시적으로 작용한 것이 아니라 연속처리에 의해 근권에 안정적으로 정착하면서 유도저항성이 발현되었고, 그 효과가 다음해까지 지속되어 단년도 처리보다 방제효과가 빠르게 나타난 것으로 사료된다. 일반적으로 토양에 유입된 길항미생물은 초기에는 토착 미생물군과의 경쟁과 환경 스트레스 등으로 인하여 정착하는데 어려움을 겪는다. 그러나 반복적으로 길항미생물을 처리하여 토양 내 밀도를 유지 및 증가시키고 토양 환경에 대해 적응시키면 장기적으로 정착 가능성을 향상 시킬 수 있다(Knights ET AL., 2024, Romano et al., 2020). 실제로 Bacillus amyloliquefaciens NJN-6을 포함한 Bio 유기질 비료를 연속적으로 처리한 연구에서는 2년 이상 연속 처리 시 시들음병 억제 효과가 유의하게 향상되었으며, 동시에 근권 내 유익 세균 군집의 안정화가 관찰되었다(Shen et al., 2015; Lin et al., 2016). 또한, 연속 처리된 미생물제제는 근권에서 항균물질 생산, 양분 경쟁, 병원균 억제성 미생물의 상대적 증가 등을 통해 토양의 억제성(suppressiveness)을 점진적으로 강화할 수 있다. Lin et al.(2016)은 연속적인 bio-organic fertilizer 처리가 근권 세균 군집의 다양성과 안정성을 높여, 병원균 침입 후에도 억제 기능을 유지하는 회복력 있는 미생물 생태계를 형성한다고 보고하였다. 또한 길항미생물 처리는 식물체의 유도저항성을 누적적으로 강화했을 가능성도 고려할 수 있다. 미생물에 의해 유도되는 ISR은 즉각적인 방어 반응보다는 프라이밍 상태를 형성하여, 이후 병원균 침입 시 방어 반응을 빠르고 강하게 유도하는 특성을 가진다(Verhagen et al., 2004). 이러한 프라이밍 효과는 단일 처리보다는 반복 처리에서 더 안정적으로 유지되며, 다년간 처리 시 식물–미생물 상호작용이 점차 안정화되는 경향이 보고되어 있다(Song and Ryu, 2018).

Fig. 3.  
Control efficacy of the prototype product applied as a single-year(A), two-year(B) and three-year(C) consecutive treatment.

MWS28 균주가 어떻게 사과나무의 병 저항성을 높이는지 그 기작을 이해하기 위해, 저항성과 관련된 세 가지 주요 유전자 그룹(항산화 관련 유전자, 병원성 관련유전자, WRKY 전사인자)의 발현양상을 RT-PCR로 분석하였다. 그 결과, MWS28 처리는 이들 방어 관련 유전자의 발현을 신속하고 강력하게 유도하는 것으로 나타났다.

MWS28 처리 후 항산화 효소 관련 유전자인 AKR(Aldo-Keto Reductase)과 CAT(Catalase)의 발현을 분석한 결과, 두 유전자 모두 처리 후 시간 경과에 따라 발현량이 유의하게 증가하였다(Fig. 4). 특히, AKR 유전자는 처리 후 12시간째에, CAT 유전자는 24시간째에 최대 발현 수준을 보인 후 점차 감소하는 경향을 보였다 관주처리시 최고 발현량은 AKR의 경우 무처리 대비 250배, CAT의 경우 10⁵배 이상이었으며, 스프레이처리시 최고 발현량은 각각 무처리 대비 5배, 17500배로 처리방법에 따른 발현량의 차이가 크게 나타났다. 항산화 유전자의 발현유도는 식물의 방어과정에서 발생하는 부수적인 피해를 최소화하는 중요한 기작이다. 병원균 침입 시 식물은 방어 신호 및 직접적인 살균 작용을 위해 활성산소종(ROS)을 폭발적으로 생산하는데, 이는 병원균 뿐만 아니라 식물 자신의 세포에도 손상을 줄 수 있다. CAT, APX와 같은 항산화효소는 과도한 ROS를 제거하여 세포를 보호하는 역할을 한다. MWS28처리에 의해 AKR, CAT 유전자의 발현이 선제적으로 증가한 것은, 식물이 본격적인 방어 반응에 돌입했을 때 발생할 수 있는 산화 스트레스에 미리 대비하도록 하여, 방어의 효율성을 높이고 부작용을 줄이는 정교한 전략으로 해석할 수 있다. 따라서 MWS28은 항산화 시스템을 미리 활성화시키는 '프라이밍' 역할을 수행함을 시사한다.

Fig. 4.  
Expression of AKR (Aldo-Keto Reductase), CAT (Catalase), and APX (Ascorbate Peroxidase) genes after MWS28 treatment. Data represent means ± SD for three technical replicates. Statistical analysis was performed using one sample Student t-test. Relative expression levels were normalized to hpi 0. Single stars denote P < 0.05, while double stars denote P < 0.01.

PR(Pathogenesis-Related) 단백질은 식물이 병원균의 공격에 맞서기 위해 생산하는 핵심적인 방어 물질 그룹이다(Zribi et al., 2021). 본 연구에서는 다양한 PR 유전자군 (PR1, PR2, PR5, PR8)의 발현 변화를 조사하였다. 그 결과, MWS28 처리 후 모든 PR 유전자의 발현이 대조군에 비해 현저하게 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 5). 정도의 차이는 있었으나 모든 PR 유전자들이 처리방법에 관계없이 12시간 이내에 무처리대비 5~48배 이상 발현량이 증가하였으며, 72시간까지 5~30배이상 높은 발현수준을 유지하였다. PR1은 전신획득 저항성(SAR)의 대표적인 표지 유전자로, 처리 후 24시간부터 급격히 발현이 증가했다. PR2와 PR8은 곰팡이 세포벽의 주성분인 글루칸과 키틴을 직접 분해하는 효소로, 이들 유전자의 발현 증가는 MWS28 처리가 곰팡이 병원균에 대한 직접적인 방어능력을 강화시킴을 의미한다. 세포막 투과성을 변화시켜 항진균 활성을 나타내는 PR5 또한 다른 PR 유전자들과 유사하게 발현이 크게 상향되었다. PR1과 PR2는 살리실산(SA) 의존적 방어 반응의 대표적인 지표 유전자로 알려져 있으며, PR5와 PR8은 SA뿐만 아니라 자스몬산/에틸렌(JA/ET) 관련 방어 반응과도 연관된 것으로 보고되어 있다(Fang et al., 2025, Han and Schneiter, 2024). 본 연구에서는 SA 또는 JA/ET 신호전달 물질의 직접적인 정량 분석은 수행하지 않았으나, 기능적으로 상이한 PR 유전자들의 이러한 동시 발현 양상은 기존 문헌에 근거할 때 SA 매개 방어 반응을 중심으로 JA/ET 관련 방어 기작이 함께 관여하는 복합적이고 다층적인 방어 반응이 유도되었을 가능성을 시사한다. 이러한 방어반응의 특성은 MWS28이 갈색무늬병, 탄저병 등 생활사가 다른 다양한 곰팡이 병원균에 대해 비교적 광범위한 방제 스펙트럼을 나타내는 기작적 배경으로 해석될 수 있다. 한편, MWS28 균주 처리가 직접적인 항균 활성과 더불어 유도저항성(ISR)을 동시에 유발하는 경우, 방어 반응의 지속적 활성화로 인해 작물체의 생장이나 자원 분배에 불리한 생리적 부담(fitness cost)이 발생할 가능성도 고려할 필요가 있다. 따라서 MWS28 처리에 따른 방어 효과와 생장 간의 균형을 평가하는 추가적인 생리·생육 수준의 검토가 요구된다.

Fig. 5.  
Expression of PR1 (Pathogenesis-Related Protein1), PR2 (β-1,3-Glucanase), PR5 (Thaumatin-like Protein, TLP), PR8 (Chitinase), and PR10 (Ribonuclease-like protein) genes after MWS28 treatment.

WRKY 전사인자는 식물 방어 신호전달 네트워크에서 상위 조절자 역할을 하는 핵심 단백질이다(Saha et al., 2023). 이들은 다양한 방어 관련 유전자들의 발현을 조절함으로써 식물의 면역 반응을 총괄한다. 본 연구에서 분석한 WRKY1, WRKY33, WRKY70 유전자는 모두 MWS28 처리에 의해 발현이 유의하게 증가하였다(Fig. 6). WRKY1과 33유전자는 처리방법에 관계없이 모두 무처리 대비 5배 이상 증가하였으며, WRKY70 유전자는 관주처리시 72시간까지 무처리 대비 5배이상 높은 발련량을 유지하였다. 특히 WRKY70과 같은 특정 전사인자는 SA와 JA 신호전달경로간의 균형을 조절하여, 생장과 방어 사이의 자원배분을 최적화하고 다양한 종류의 병원균에 효과적으로 대응하도록 돕는다(Emma et al., 2024). 이 유전자의 발현 증가는 MWS28이 식물의 복잡한 호르몬 네트워크를 정교하게 조절하여 최적의 방어 상태를 유도함을 보여준다. WRKY33 역시 식물성 항균물질 생합성을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 따라서 WRKY1, WRKY33, WRKY70의 발현이 모두 증가한 것은 MWS28이 단순히 개별 방어 유전자를 활성화하는 것을 넘어, 식물의 전체적인 방어시스템을 자극하여 광범위하고 체계적인 저항성 반응을 이끌어낸다는 것을 입증하는 중요한 결과이다.

Fig. 6.  
Expression of WRKY transcription factor genes after MWS28 treatment.