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본 연구에서는 국민건강영양조사의 식품 섭취 빈도 자료(한국보건산업진흥원 국민영양통계(KHIDI), 2023)를 바탕으로 국내에서 소비량이 높은 농산물 28개 품목을 분석 대상으로 선정하였다. 식품의약품안전처의 식품군 분류 기준에 따라 곡류, 서류, 과일류, 채소류, 버섯류의 5개 대분류로 구분하였으며 각 식품군 내에서 대표성과 검사의뢰 빈도가 높은 품목을 우선적으로 선정하였다. 최종 선정된 품목은 곡류 1종, 서류 2종, 과일류 6종, 채소류 18종, 버섯류 1종으로 구성되었으며, 각 품목에는 고유 식별코드를 부여하여 분석에 활용하였다(Table 1).

시료의 사전 잔류농약 오염 가능성을 최소화하기 위하여, 유기농 및 무농약 인증을 받은 친환경 농산물을 구입한 후, 식품공전 7.1.2.2 잔류농약 시험법에 따라 사전 검사를 실시하였다. 그 결과, 모든 대상 농약 226종(251성분)이 검출되지 않은 시료에 한하여 실험에 사용하였다.

전처리 및 분석에 사용된 시약은 HPLC 등급의 acetonitrile(J.T.Baker, Phillipsburg, NJ, USA), methanol (Merck, Darmstadt, Germany), water (Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다. 이동상 조제에는 formic acid (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA)와 ammonium acetate (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. QuEChERS 전처리에는 CHROMAtific (Heidenrod, Germany)사의 extraction kit(sodium citrate 1 g, disodium hydrogencitrate sesquihydrate 0.5 g, magnesium sulfate 4 g 및 sodium chloride 1 g)와 d-SPE kit(900 mg MgSO₄, 150 mg PSA)를 사용하였다. 시료의 균질화 및 추출에는 진탕기(SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ, USA)와 원심분리기(LaboGene, Allerød, Denmark)를 이용하였다.

분석 대상은 식품공전 7.1.2.2 다성분 시험법에 따라 선정된 농약 226종을 대상으로 하였다(Table 2). 이 중 이성질체나 대사체는 실제 분석에서 개별 피크로 분리되어 각각의 검량선이 작성되므로, 최종적으로는 총 251개 성분을 대상으로 분석을 수행하였다. 농약 표준품은 AccuStandard (New haven, CT, USA)와 Chiron (Trondheim, Norway)에서 구입하였다. 액상 표준품은 원액 농도 100 mg/L로 사용하였으며, 분말 형태의 표준품(neat)은 carbendazim (순도 97.8%)과 thiophanate-methyl (순도 98.1%)을 사용하였다. 이 표준품들은 acetonitrile에 녹여 5 mg/L 농도의 stock solution으로 제조한 후, 필요시 단계적으로 희석하였다.

검량선 조제를 위해 무처리 시료 추출물과 표준품을 9:1 (v/v) 비율로 혼합하여 최종 농도 6.25, 12.5, 25, 100 µg/L의 matrix-matched calibration standard를 조제하였다. 검량선 범위는 실제 분석에서 검출 가능한 농도 범위를 충분히 반영하도록 설정하였으며 모든 농약 성분에서 결정계수(R²≥0.98)의 직선성이 확보되어 4개 농도 수준의 검량선으로도 정량 분석에 충분한 타당성을 확보하였다.

LC-MS/MS 다성분 잔류농약 분석법 유효성을 검증하기 위해, 식품의약품안전평가원 가이드라인에 따라 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantitation, LOQ), 정확도(accuracy), 정밀도(precision)를 평가하였다(Table 4). 검량선은 무처리 농산물 추출물을 이용한 matrix-matched 방식으로 작성하였으며, 분석 대상인 226종(251성분) 모든 농약에서 결정계수(R²)가 0.98 이상으로 우수한 직선성을 나타냈다. LOD 및 LOQ는 각각 0.13 – 3.28 μg/kg, 0.41 – 9.94 μg/kg 범위로, 식품공전의 잔류허용 기준 0.01 mg/kg(10 μg/kg)을 충족하는 수준이었다. 정확도 및 정밀도 평가는 대표 농산물 3종(고구마, 포도, 고추)을 대상으로 실시하였으며, 전체 농약 회수율은 64.5 – 118.3% 범위였고, 모든 항목에서 상대 표준편차(RSD)는 15% 이하로 나타나, 본 시험법은 가이드라인 기준에 모두 적합함을 확인하였다(NIFDS, 2016; KOLAS, 2024).

다소비 농산물 28개 품목에 대해 농약 226종(251성분)의 검량선 기울기를 아세토니트릴(Acetonitrile, ACN) 용매 검량선 기울기와 비교하여 매질효과를 산출하였으며, 이를 3회 반복하여 평가하였다(Fig. 1). 그 결과, 이온 억제(ion suppression)는 전체 데이터의 76.8%, 이온 증강(ion enhancement)은 23.2%를 차지하였으며, 이는 LC-MS/MS의 전자분무이온화(Electrospray Ionization, ESI) 과정에서 이온 억제가 일반적으로 우세하다는 기존 연구 결과와 일치하였다(Mohammed et al., 2020). 한편, 일부 인과류 품목에서는 예외적인 경향이 관찰되었다. 특히 감(FP)의 경우, 전체 농약 성분 중 92.4%(232 성분)에서 이온 증강 현상이 나타났으며 사과(FA)에서도 유사한 경향이 확인되었다. 이는 매질 내 특정 성분이 이온화 보조제로 작용하여 이온화 효율을 증가시킨 것으로 추정된다. 일반적으로 매질 내 유기산 및 당류 등은 전하 전달을 촉진하여 이온화 증강을 유발하는 반면 색소, 페놀성 화합물 및 지방산 등은 이온 소스 내에서 분석 성분과의 경쟁으로 인해 이온화 억제를 일으키는 것으로 보고되어 있다(Steiner et al., 2020). 이러한 기전은 LC-MS/MS 분석에서 매질효과의 주요 원인으로 작용하며, 감(FP)에 함유된 당류 성분이 이온화 보조제 역할을 하여 농약 대부분 성분에 이온 증강 현상이 나타난 것으로 해석된다. 그러나 감(FP)에서 관찰된 이온 증강은 대부분의 성분이 ±20% 이내의 soft 매질효과 범위에 해당하였으며, 이는 정량 분석의 신뢰도에는 큰 영향을 미치지 않는 수준이었다. 이러한 결과는 매질 내 이온화 증강 및 억제 효과가 서로 균형을 이루어 전체 매질효과가 허용 가능한 수준으로 유지했기 때문으로 해석된다. Fig. 1은 품목별 매질효과 분포를 히트맵(heat map)으로 시각화하여 전반적인 양상을 보여주며, Fig. 2에서는 매질효과 정도(%)를 soft (≤ ±20%), medium (±20 – 50%), strong (> ±50%) 기준으로 분류하여 비교하였다. 감(FP)와 쌀(R)은 soft 매질효과 비율이 각각 99.2%, 98.8%로, 용매 대비 매우 낮은 매질 간섭 수준을 보였으며, 사과(FA), 감자(PP), 양상추(LI), 백오이(C) 역시 soft 범위가 90% 이상으로 나타나 전반적으로 매질 간섭이 낮은 품목군으로 분류되었다. 반면, 마늘(RG)과 양파(RO)의 경우, medium 및 strong 범위에 해당하는 비율이 각각 92.0%, 84.4%로 나타났으며, 매질 보정을 하지 않을 경우 분석 결과에 큰 오차가 발생할 수 있는 수준이었다. 이와 유사하게, 부추(SC), 대파(SG), 깻잎(LP), 귤(FM)에서도 medium 및 strong 수준의 매질 간섭이 높았다. 특히 Allium 속 작물(마늘, 양파, 부추, 대파)은 절단이나 분쇄와 같은 물리적 처리 과정에서 allyl sulfide 계열의 유기 황화합물을 생성함으로써, LC-MS/MS 분석 시 강한 매질효과를 유발한다고 보고되었다(Raposo and Barcelo, 2021). 깻잎은 방향족 및 정유 성분 등 다양한 매질 성분을 포함하고 있어 이온화 간섭 가능성이 높은 복합 매질로 분류되며(Na et al., 2012), medium 및 strong 수준의 매질 간섭 비율이 68.6%로 나타났다(Fig. 2). 감귤(FM)의 경우, naringin, nomilin, limonin 등 flavonoid 및 triterpenoid 계열 천연 성분이 함께 용출되어 농약의 이온화를 억제한 것으로 판단된다(Besil et al., 2017).

Fig. 1. 
Heat map of matrix effect in 28 agricultural commodities.

Fig. 2. 
Intensity distribution of matrix effect in 28 agricultural commodities.

농약 성분별 분석 결과, bistrifluron, fluazinam, flusulfamide는 모든 농산물 매질에서 일관된 이온 증강 특성을 나타냈다(Fig. 1). 이들 성분은 방향족 고리 내에 할로겐 치환기를 포함하고 있으며, 아민기(–NH₂) 또는 아마이드기(–CONH₂)와 같은 질소(N) 기반 극성 작용기를 함께 가지는 구조적 특성을 가진다. 이러한 구조는 전기음성 치환기에 의한 분자 내 이온 안정화와 높은 양성자 친화도(proton affinity)를 유도하여 ESI(전자분무 이온화) 조건에서의 이온 생성 효율을 증가시키는 요인으로 작용한 것으로 해석된다(Kebarle and Verkerk, 2009; De Vijlder et al., 2018). 그러나 flubendiamide는 유사한 구조적 특징을 지녔음에도 불구하고 이온 증강이 아닌 이온 억제 현상이 우세하게 관찰되었다. 이는 농약 성분의 물리·화학적 특성만으로 매질효과의 복합성을 완벽히 설명하기 어렵다는 점을 시사한다. 한편, dodine은 귤(FM) 매질에서만, propamocarb는 고추(P) 매질에서만 이온 억제 현상을 보였으며, 그 외 매질에서는 모두 이온 증강을 나타냈다. 이는 농약 성분 외에도 농산물 매질 내 당류, 유기산, 지방산 등 다양한 성분이 이온화 경쟁, 이온 분무 안정성 저하 등 다양한 방식으로 매질 효과에 영향을 미친다는 점을 보여준다(Cortese et al., 2020; Kebarle and Verkerk, 2009). 종합적으로, 농약분석에서 발생하는 다양한 매질효과는 농약 성분의 물리·화학적 특성과 함께 분석 대상 농산물 매질의 복합적인 특성이라는 두 가지 주요 요인에 의해 영향을 받는 것으로 판단된다. 이러한 결과는 농약 성분 자체의 특성보다 농산물별 매질 특성이 매질효과에 더 큰 영향을 미친다는 기존의 연구와 일치한다(Choi, 2023).

LC-MS/MS 기반 다성분 잔류농약 분석에서 발생하는 매질효과를 저감하기 위한 방안으로 다소비 농산물 28품목을 대상으로 대체 매질(alternative matrix) 활용 가능성을 평가하였다. 각 농산물의 무처리 추출물을 기준 매질(reference matrix)로 설정하고, 이를 바탕으로 나머지 27개 품목 시료에서 226종(251성분) 농약의 매질효과를 기울기 비율에 기반해 3회 반복 평가하였다. 그 결과, 총 189,756건의 데이터(251 농약 성분 × 27개 비교 품목 × 28개 기준 매질)가 생성되었으며 이를 바탕으로 각 대체 매질 적용 시 soft, medium, strong 범위에 해당하는 농약 성분 수를 비교하여 매질효과 개선 여부를 검토하였다.

또한, 복합적인 매질효과 양상을 구조적으로 파악하고자 다변량 통계 분석기법인 PCA와 HCA를 수행하였다. 이러한 다변량 통계 분석기법은 대사체학(metabolomics) 분야에서 활용되어 왔으며(Worley and Powers, 2013), 최근 매질 효과 분석에서도 그 활용성이 입증되고 있다(Łozowicka et al., 2017; Yan et al., 2013; Zhang et al., 2023). 본 연구는 이러한 통계적 접근 방식을 통해 농산물 매질의 복합적인 특성을 분류하고, 범용 대체 매질 선정에 있어 과학적 근거를 제시하는 것을 목적으로 하였다.

PCA를 활용한 품목 간 매질효과 특성 분석

각 농산물을 대체 매질로 적용하였을 때 농산물 간 매질 효과의 주요 변동성을 파악하기 위하여 매질효과 데이터를 기반으로 PCA를 수행하였다(Fig. 3A). 분석 결과, 제1 주성분(PC1)은 전체 변동성의 67.38%, 제2 주성분(PC2)은 8.84%를 설명하였으며 두 축을 통해 전체 데이터 변동성의 약 76.22%를 설명할 수 있었다. 특히 PC1(67.38%)을 기준으로, 마늘(RG), 양파(RO), 깻잎(LP), 부추(SC), 대파(SG), 귤(FM)은 독립적인 클러스터(cluster)를 형성하였으며, 그 외 수박(W), 애호박(Z), 양상추(LI) 등 22개 농산물과 명확히 구분되는 독립적인 패턴을 나타냈다. 이는 해당 그룹의 6개 품목이 다른 22개 농산물과 비교해 뚜렷하게 다른 매질효과 특성을 지니고 있음을 의미한다.

Fig. 3. 
Multivariate classification of matrix effect patterns in 28 agricultural commodities: PCA (A) and HCA (B).

최적의 대체 매질 평가

제II군집 내 최적의 대체 매질 후보를 선별하기 위해 다음 두 가지 분석법을 수행하였다.

첫째, 각 품목을 대체 매질로 사용했을 때 226종(251성분) 농약에 대한 매질효과 분포(soft, medium, strong)를 비교하였다. 그 결과, 251성분 농약 중 soft 매질효과(≤ ±20%)에 해당하는 성분의 비율이 수박(W)이 91.7%로 가장 높았으며, 애호박(Z) 91.0%, 백오이(C) 90.8% 순이었다(Fig. 4). 제II군집 내 22개 품목에 수박(W), 애호박(Z), 백오이(C)를 대체 매질로 적용한 경우, 전체 농약 성분의 90% 이상이 soft 매질효과 범위에 해당하였으며 이는 대부분의 농약 분석에서 충분한 신뢰성 확보가 가능함을 시사한다. 또한 수박(W), 애호박(Z), 백오이(C)의 medium 비율은 7~9% 였고, strong 범위는 약 0.5%에 불과하여 정량값에 유의한 영향을 미칠 수 있는 농약 성분의 비율이 상대적으로 낮아 대체 매질 적용 시 군집 전체에 대한 보정 효과가 크다고 판단되었다. 둘째, 제II군집 중심과 품목 간의 유클리드 평균 거리를 산출하여 군집의 대표성을 평가한 결과(Table 6), 수박(W) 10.4, 애호박(Z) 11.9, 백오이(C) 15.7 순으로 군집 중심에 가까워 이들 품목이 군집 내 농산물들의 매질효과 특성을 효과적으로 대표할 수 있음을 확인하였다.

Fig. 4. 
Bubble plot of matrix effect distribution among 22 substitute matrices in Cluster Ⅱ (Note: The X-axis represents the percentage of soft matrix effects (≤ ±20%), Y-axis shows medium matrix effects (±20 – 50%), and bubble size corresponds to strong effects (> ±50%). The strong effect percentage is also displayed numerically next to each matrix.)

선행 연구에서도 오이의 대체 매질 적합성이 보고된 바 있으며(Vidal et al., 2005), 동일한 박과 과채류인 수박(W)과 애호박(Z) 역시 낮은 매질효과를 나타내어 범용 대체 매질로서의 가능성을 시사하였다. 이는 높은 수분 함량과 낮은 색소·섬유소·지방산 등의 함량으로 인해 공추출물(co-extractives)이 적게 발생하며, LC-MS/MS 분석 시 이온화 간섭이 낮은 것으로 추정된다(Kwon et al., 2018; Romero-González et al., 2006; Vidal et al., 2005).

종합적으로, 본 연구에서는 모든 품목과 농약 성분의 매질효과를 100% 개선할 수 있는 완벽한 대체 매질은 없었다. 그러나 수박(W), 애호박(Z), 백오이(C)는 soft 매질효과 비율, 군집 대표성, 실용성을 모두 고려했을 때 제II군집 내에서 범용 대체 매질로 활용 가능한 최선의 후보로 판단되었다. 본 연구에서 언급한 실용성은 단순한 통계적 적합성을 넘어 실제 분석 현장에서 품목별 개별 검량선 작성 부담을 줄이고 분석 시간과 비용을 절감하면서도 다양한 품목 분석에서 충분한 신뢰성을 확보할 수 있음을 의미한다. 다만, medium 및 strong 수준의 매질효과를 보이는 일부 농약 성분은 개별 보정이 병행되어야 함을 전제로 한다.