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국내에서 관리하고 있는 농약 원제 목록을 대상으로 분석하였다(농약관리법 고시에 따른 농약 원제 목록 참고, 농촌진흥청고시 제 2025-16호). 농약 원제의 화학물질명을 EPA의 DTXSID (DSSTox Substance Identifier) 식별자 코드로 전환한 후 매칭된 ID를 기준으로 데이터를 추출하여 분석하였다.

EPA Tox21/ToxCast 데이터베이스의 in vitro 데이터를 활용하였다(https://tripod.nih.gov/pubdata/). 농약 원제의 화학물질명을 DTXSID 식별자 코드로 전환하여 매칭된 ID를 기준으로 데이터를 추출하였다. 데이터베이스에서 제공하고 있는 데이터 중에서 AR 및 ER과 관련된 각 6개, 8개의 분석법으로부터 in vitro 데이터를 수집하였다(Table 1). 결과값은 데이터베이스가 제공하고 있는 활성/비활성 판정(active/inactive call) 기준에 따라서, 각 농약 원제 물질에 대해서 분석법별로 활성이 나타난 결과값을 계수하였다.

EPA Tox21/ToxCast 데이터베이스에서 2020년 9월 공개한 데이터베이스(InVitroDB) 3.3 버전에서 제공하는 모델 결과값을 활용하였다. EPA 화학물질의 경우, ER 및 AR pathway 모델의 결과값을 가지고 있는 1,790개에 대하여 분석하였고, 국내 농약원제의 경우, 결과값을 가지고 있는 ER 208개, AR 210개 물질에 대해 분석하였다. ER과 AR의 작용제 및 길항제 활성 정도는 AUC(Area Under the Curve) 값에 따라 EPA에서 권고하는 기준으로 아래와 같이 분류하였다: ≥ 0.1 = 활성(active); 0.01 − 0.1 = 판정 불가(inconclusive); < 0.01 = 비활성(inactive)

EPA Tox21/ToxCast 데이터베이스에서 2020년 9월 공개한 InVitroDB 3.3 버전에서 제공하는 합의 QSAR 모델 결과값을 활용하였다. CERAPP 및 CoMPAR A 모델을 활용하여, ER 및 AR에 대한 작용제, 길항제, 결합 예측값을 활용하였다(EPA, 2020b). 화학물질 중 중복된 DTXSID 식별자를 가진 것은 제거하고 결과값을 가지고 있는 전체 물질을 대상으로 분석하였다.

농약 원제에 대한 ER 및 AR 관련 내분비계 활성 가능성을 평가하기 위해, 미국 EPA의 Tox21/ToxCast 데이터베이스에 수록된 in vitro 시험법 결과(ER 관련 8종, AR 관련 6종)를 수집하여 분석하였다(Table 1). 각 시험은 작용제(agonist)와 길항제(antagonist) 활성을 다양한 세포모델(HEK293, BG1, MDA-MB-453 등)에서 평가한 결과로 구성되며, 이를 바탕으로 농약 원제의 in vitro 내분비계 활성 가능성을 체계적으로 분석하였다(Fig. 1).

Fig. 1. 
Data distribution of domestic pesticides with in vitro ER and AR Assay results from Tox21/ToxCast Database. Distribution of pesticides with available data from a) 8 ER and b) 6 AR in vitro assays. Out of a total of 510 pesticides, 268 and 247 had active or inactive values from at least one assay for ER and AR, respectively. For each ER and AR assay, the number of pesticides with active ER or AR calls was counted.

510개 농약 원제 중 ER 또는 AR 시험 데이터가 확보된 원제는 각각 268개(52.5%)였다. 반면, ER 및 AR 시험 데이터가 모두 없는 원제는 242개(47.5%)로, 전체의 약 50%는 Tox21/ToxCast 프로젝트에서 시험이 수행되지 않았음을 알 수 있다. ER 및 AR 시험 중 1개 이상에서 활성(active call) 판정을 받은 농약 원제는 각각 131개(25.7%), 142개(27.8%)로 확인되었고, 비활성(inactive call)으로 분류된 원제는 각각 137개(26.9%), 126개(24.7%)였다. 또한, ER 및 AR 시험 모두에서 1개 이상 활성을 보인 농약 원제는 131개로, 상당수 농약 원제가 복수 호르몬 수용체에 대해 교차 활성을 나타낼 가능성이 있음을 시사한다.

Tox21/ToxCast 프로그램에서 수행된 ER 및 AR 관련 다양한 in vitro 시험은 농약 원제의 내분비계 활성 평가를 위한 초기 스크리닝 자료로 활용될 수 있다. 그러나 시험법 별 결과값에 차이가 많아, 단일 시험법 결과만으로 내분비계 활성을 명확히 판단하기에는 한계가 있었다. 따라서 ER 및 AR 활성을 보다 신뢰성 있게 평가하기 위해서는 여러 in vitro 시험법 결과를 통합적으로 분석할 수 있는 모델의 적용이 필요함을 확인하였다.

본 연구에서는 단일 in vitro 시험법 결과에서 발생할 수 있는 불일치성을 보완하고, ER 및 AR 활성을 보다 종합적으로 평가하기 위해 미국 EPA의 ToxCast Pathway 모델을 활용하였다. ToxCast Pathway 모델은 실제로 수행된 다양한 in vitro 시험법 결과를 수학적으로 통합하여, 화학물질의 수용체 활성 가능성을 정량적으로 평가하는 모델이다. ER Pathway 모델은 18개, AR Pathway 모델은 11개의 시험법을 기반으로 개발되었으며, 두 모델 모두 참조물질(reference chemicals)을 이용한 검증을 통해 0.95 이상의 높은 균형 정확도(balanced accuracy, BA)를 보여 신뢰성이 입증되었다. ToxCast Pathway 모델은 미국 EPA가 보유한 1,790개의 화학물질 각각에 대해 여러 in vitro 시험법에서 얻어진 데이터를 통합 알고리즘으로 분석하여, ER 및 AR의 작용제와 길항제 활성 가능성을 AUC(Area Under the Curve) 점수로 정량화하였다. AUC 점수는 값이 높을수록 해당 수용체에 대한 활성 가능성이 높음을 의미한다.

EPA의 1,790개 화학물질 중 농약 원제에 해당하는 물질의 AUC 점수를 조사하여, 전체 EPA 화학물질 그룹과 농약 원제 그룹 간의 내분비계 활성 분포를 비교 분석하였다(Fig. 2). AUC 점수 분포를 분석한 결과, EPA 전체 화학물질에서는 AR 길항제, ER 작용제, AR 작용제, ER 길항제 순으로 AUC 점수 0.1 이상을 보이는 물질이 많았다. 특히 AR 작용제 활성에서 AUC 1.0을 초과하는 매우 높은 활성을 보이는 물질이 다수 관찰되었으며, ER 길항제 활성 물질은 상대적으로 적게 분포하고 있었다. ToxCast Pathway 모델 결과값을 가지고 있는 농약 원제의 AUC 분포를 분석한 결과, AR 길항제, ER 작용제, AR 작용제 순으로 AUC 0.1 이상을 보이는 물질이 분포하고 있었다(Fig. 2a). ToxCast Pathway 모델의 활성 판정 기준에 따라, AUC 점수가 ‘0.1 이상(AUC ≥ 0.1)인 경우를 활성(active)’으로, ‘0.01 이상 0.1 미만(0.01 ≤ AUC < 0.1)’은 판정 불가(inconclusive)로, 그리고 ‘0.01 미만 (AUC < 0.01)은 비활성(inactive)’으로 분류하였다(Fig. 2b). 그 결과, 1,790개의 EPA 화학물질 중 321개가 활성으로 분류되었고, 세부적으로는 ER 작용제 91개(5%), ER 길항제 18개(1%), AR 작용제 33개(2%), AR 길항제 179개(10%)가 활성으로 확인되었다. 농약 원제의 경우, 총 44개가 활성으로 분류되었으며, 이 중 ER pathway 모델에서는 ER 작용제는 4개(1.9%), ER 길항제는 활성으로 확인된 물질이 없었다. AR Pathway 모델에서는 AR 작용제가 1개(0.5%), AR 길항제가 39개(18.6%)로 활성 물질로 분류되었다(Fig. 2b). 이와 같이, ToxCast Pathway 모델을 활용하여 농약 원제 중에 AR 길항제 활성 가능성이 있는 물질을 스크리닝할 수 있었다.

Fig. 2. 
Analysis of ToxCast Pathway model results for EPA chemicals and domestic pesticides. a) Distribution of AUC scores; b) Proportion of chemicals by activity classification. Model outputs from the EPA Tox21/ToxCast InVitroDB v3.3 were analyzed. a) Violin plots depict the distribution of AUC scores for 1,790 EPA chemicals, focusing on pathway models for ER agonists/antagonists and AR agonists/antagonists. b) Based on ToxCast pathway model classification criteria, chemicals were categorized as active (AUC ≥ 1), inactive (AUC < 0.01), or inconclusive (0.01 ≤ AUC < 0.1). The number of chemicals in each category was quantified.

ToxCast Pathway 모델은 참조물질을 활용한 검증을 통해 높은 균형 정확도를 보였으나, 신규 화학물질에 대한 ER 및 AR 활성 예측을 위해서는 in vitro 시험법 데이터가 반드시 필요하다. 이러한 한계를 보완하기 위해, CERAPP 및 CoMPARA 프로젝트를 통해 화학물질의 분자 구조만으로 활성을 예측하는 합의 QSAR 모델이 도입되었으며, 선행연구에서 0.74~0.91 수준의 예측 정확도가 보고된 바 있다(EPA, 2022). 따라서, 합의 QSAR 모델의 활용성을 검증하고자 ToxCast Pathway 모델의 결과와 비교 분석을 실시하였다.

ER 활성을 예측한 합의 QSAR 모델 (CERAPP) 결과는 데이터베이스에서 강함(strong), 보통(moderate), 약함(weak), 매우 약함(very weak), 비활성(inactive) 등으로 등급별로 정리되어 제공된다. 본 연구는 35,737개 화학물질에 대한 ER 작용제, 길항제, 결합 활성 예측 결과를 각 등급별로 분석하여 화학물질 수를 파악하였다(Table 2). AR 활성을 예측한 합의 QSAR 모델(CoMPARA) 결과는 데이터베이스에서 활성과 비활성으로 구분되어 제공된다. 본 연구에서는 63,848개 화학물질에 대해 AR 결합, 작용제, 길항제 활성 예측 결과의 각 분류별(활성/비활성) 화학물질 수를 분석하였다(Table 2). 또한, ER 합의 QSAR 모델에서는 등급 중 매우 약함 이상을 활성으로 간주하여 ToxCast Pathway 모델과 결과값을 비교하였다(Table 3). ToxCast Pathway 모델은 작용제와 길항제에 대한 예측값을 제공하며, 합의 QSAR 모델은 작용제, 길항제, 결합 등 세 가지 예측값을 제공한다. 이에 따라 본 연구에서는 QSAR 모델의 작용제 및 길항제 예측값뿐만 아니라 결합 예측값과의 상관관계도 함께 비교하였다.

혼동 행렬(confusion matrix) 결과를 바탕으로, QSAR 모델의 예측 정확도를 민감도(sensitivity, true positive rate), 특이도(specificity, true negative rate), 그리고 BA로 평가하였다. 분석 결과, ER 합의 QSAR 모델에서 작용제 예측의 BA는 0.89, 길항제 예측의 BA는 0.78로 나타나 길항제 예측의 BA가 상대적으로 낮았다. ER 결합 예측값을 기준으로 한 작용제 및 길항제 예측의 BA는 각각 0.95, 0.77로, 결합 예측에서 특히 높은 BA를 보였다. AR 합의 QSAR 모델에서는 작용제와 길항제 모두에서 예측의 BA가 0.94로 매우 높았으며, AR 결합 예측값을 기준으로 한 작용제 및 길항제 예측의 BA 역시 각각 0.88, 0.94로 높은 BA를 보였다.

종합적으로, 농약 원제에 대한 ER 및 AR 활성 예측에 합의 QSAR 모델 예측값을 활용할 경우, ER 길항제 예측값은 정확도가 다소 낮은 점을 감안해야 하며 ER 결합 예측값을 함께 고려하는 것이 바람직하다. 한편, AR 활성에 대한 QSAR 예측값은 ToxCast Pathway 모델 결과와 높은 일치성을 보이는 것으로 확인되었다.

ToxCast Pathway 모델의 예측값이 제공되는 농약 원제는 약 200개로 제한적이므로, 510개 농약 원제를 대상으로 합의 QSAR 모델의 예측값을 추가로 분석하였다(Table 5). ER 활성을 예측하는 ER 합의 QSAR 모델의 예측값을 보유한 농약 원제는 425개, AR 활성을 예측하는 AR 합의 QSAR 모델의 예측값을 보유한 농약 원제는 453개로 확인되었다.

ER 활성 예측 결과, 각각 4개, 14개, 17개의 농약 원제가 작용제, 길항제, 결합 활성으로 분류되었으며, 대부분의 농약 원제는 비활성으로 분류되었다. AR 활성 예측에서는 7개, 139개, 112개의 농약 원제가 각각 작용제, 길항제, 결합 활성으로 분류되었다. 이러한 분포는 ToxCast Pathway 모델의 ER 및 AR 활성 예측 결과와 유사한 경향을 보였다. 이상의 결과를 바탕으로, ToxCast Pathway 모델과 합의 QSAR 모델의 예측값을 통합 분석하여 잠재적 ER 및 AR 활성 물질을 스크리닝하였다. 이들 중 각 예측 모델에서 활성 가능성을 나타낸 15개 농약 원제를 Table 6에 제시하였다. ER 및 AR 활성 가능성을 보이는 물질로는 리누론(linuron), 빈클로졸린(vinclozolin) 및 페나리몰(fenarimol) 등이 확인되었으며, 이들은 기존 연구에서 내분비계 교란물질로 의심되는 물질들로서 본 연구의 QSAR 예측모델에서도 활성 가능성이 예측되었다.

ToxCast Pathway 및 합의 QSAR 모델과 같은 NAMs 기술은 잠재적인 내분비계장애물질의 신속한 스크리닝 및 우선순위 결정에 유용한 도구로 활용될 수 있다. 이에 따라 미국 EPA 등 주요 국제 규제기관에서는 NAMs 기술의 신뢰성과 적용 가능성을 확보하기 위해 양성대조물질을 활용한 검증 연구를 지속적으로 수행하고 있다. 그러나 이러한 예측기술의 신뢰성 및 적용 범위에 대해서는 여전히 추가적인 검증과 연구가 필요한 상황이다(EPA, 2022). 본 연구에서는 국내 농약 원제를 대상으로 ToxCast Pathway 모델과 합의 QSAR 모델의 예측 결과를 비교 분석하였다. 분석 결과 ER 및 AR 활성 가능성이 있는 농약 원제를 효과적으로 스크리닝할 수 있었으며, 향후 기존의 동물실험 결과와 비교 검증을 통해 QSAR 예측모델의 활용 가능성을 추가로 검토할 필요가 있다. 또한, 농약 원제에 대한 ER 및 AR 활성 예측에서 EPA 합의 QSAR 모델을 활용한 결과, AR 활성 예측값은 ToxCast Pathway 모델과 높은 일치성을 보였으나, ER 길항제 예측값의 정확도가 상대적으로 낮아 ER 결합 예측값에 대해서는 추가적인 검증 및 보완이 필요할 것으로 생각된다. 본 연구는 NAMs 기반 ER 및 AR 활성 예측모델의 활용 가능성을 제시함으로써 기존 시험법의 한계를 보완할 수 있는 새로운 내분비계 장애물질 평가 체계의 가능성을 제시하고 있다. 향후 NAMs 기술의 검증과 표준화가 이루어지면 기존 평가 모델을 보완하거나 대체하여 독성 예측 정확도 향상과 동물 실험 필요성 감소에 기여하고, 나아가 규제 과학 발전에 중요한 역할을 할 것으로 판단된다.