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응애과(Tetranychidae family)에는 1,300종 이상이 알려져 있고, 그 중 약 100종은 식물을 가해하는 해충이며 특히 약 10종은 주요 해충으로 간주된다(Migeon and Dorkeld, 2021). 특히 점박이응애(Tetranychus urticae Koch)는 전 세계적으로 분포하는 주요 해충 중 하나로 1,100종 이상의 식물을 숙주로 삼는다. 점박이응애의 성충과 약충은 구기를 잎에 찔러 엽록소 등 내용물을 섭취하며 잎 표면에 연한 흰 반점을 만든다. 또한 식물을 거미줄로 덮고 낙엽을 유도하며, 꽃을 감소시키는 등 원예작물 및 농업작물에 큰 경제적 손실을 야기한다(Lee et al., 2004; Lee et al., 2003; Migeon et al., 2010; Van Leeuwen et al., 2013). 이러한 점박이응애 방제를 위해서는 주로 화학적 방법을 사용하고 있으나(Ilias et al., 2014; Van Nieuwenhuyse et al., 2009), 현재까지 상업적으로 등록되어 있는 거의 모든 살비제에 대한 저항성이 발달되어 있는 것으로 보고되었다(Kim et al., 2019; Lee et al., 2010). 점박이응애는 발육기간이 짧아 연간 발생세대수가 높고, 이동성이 적어 살비제에 의한 도태의 기회가 많고 외부로부터의 감수성 개체 유입이 적으므로 다른 해충들에 비해 저항성 발달이 빠르게 나타난다(Ilias et al., 2017; Khalighi et al., 2016; Riga et al., 2017). 또한 점박이응애는 교차저항성 뿐만 아니라 복합저항성이 출현하여 전 세계적으로 문제가 되고 있다(Hollingworth and Dong, 2008; Khajehali et al., 2011; Sparks and Nauen, 2015; Stumpf et al., 2001; Van Leeuwen and Dermauw, 2016; Van Leeuwen et al., 2013).

Abamectin은 방선균인 Streptomyces avermitilis의 발효물질에서 얻은 성분으로 강력한 살비, 살충 및 살선충 활성을 가지고 있다(Clark et al., 1995). 국내에는 다양한 응애 및 곤충에 대한 방제제로 등록되어 있다(KCPA, 2019). Bifenazate는 미토콘드리아 cytochrome b (cytb)의 complex III를 억제하여 세포의 에너지 이용을 방해하는 기작을 가지고 있다(Sparks and Nauen, 2015; Van Leeuwen et al., 2010). 알과 성충 모두에 효과적이며 국내에는 귤응애, 사과응애, 점박이응애, 차먼지응애, 차응애에 대한 방제제로 등록되어 있다(KCPA, 2019). Etoxazole은 1980년대 중반에 개발된 oxazoline계 화합물로 키틴합성효소 1(chitin synthase 1, CHS1)에 작용하는 성장억제제 및 탈피억제제로써 알에 대한 효과는 크지만 성충에 대해서는 살비력이 미비하다. 그러나 약제 저항성 발달이 매우 빠른 약제로 알려져 있다(Kobayashi et al., 2001; Lee et al., 2003; Sparks and Nauen, 2015; Tomlin, 2000). Fenpropathrin은 피레스로이드계 화합물로써 신경독성 활성을 가지고 있고(Ryu et al., 1996), voltage-gated sodium channels (vgsc)에 작용하는 것으로 알려져 있다(Sparks and Nauen, 2015). Pyflubumide는 미토콘드리아 complex II의 전자전달을 억제하여 살비효과를 나타내며(Sparks and Nauen, 2015), 국내에는 귤응애, 사과응애, 점박이응애에 대한 방제제로 등록되어 있다(KCPA, 2019). Pyridaben은 pyridazine 화합물로 coenzyme site Q₀에서 미토콘드리아 respiratory chain의 complex I에 결합하여 전자 전달 저해를 통한 대사 억제 능력을 가진 살비제이다(Hirata et al., 1988; Hollingworth and Ahammadsahib, 1995; Lümmen, 2007; Sparks and Nauen, 2015). 국내에는 응애류 및 가루이류에 대한 방제제로 등록되어 있다(KCPA, 2019).

단백체학(Proteomics)은 2차원 전기영동(2D-PAGE, two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis)와 MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry)를 병행한 분석기술로 분자적 수준에서의 단백질 합성 변화를 비교하는데 유용하게 쓰인다(Kundu et al., 2013; Nicholson et al., 2012). 이 외 유전체학(Genomics)는 어떤 유전자가 존재하는지를 밝히는 학문이고, 전사체학(Transcriptomics)는 서로 다른 세포에서 유전자가 얼마나 활성화되어 있는지를 연구하는 학문이다. 이러한 기술들은 살충제 저항성과 관련된 유전자의 발견을 가속화하는 데 크게 기여했지만 풍부한 단백질의 생화학적 복잡성을 밝히는 데에는 한계가 있다. 지금까지 proteomics기술을 이용한 해충의 약제 저항성 집단의 전반적인 단백질 합성 패턴을 감수성 집단과 비교한 연구는 많지 않다. 최근에 우리 연구진은 포스핀(phosphine, PH₃) 훈증제에 저항성을 보이는 쌀바구미(Sitophilus oryzae)와 감수성 쌀바구미에서 단백질을 추출하여 두 그룹간 단백질 합성정도를 비교했다(Koo et al., 2021b).

본 연구에서는 7개 야외 지역에서 채집한 점박이응애 알과 성충에 대해 6개의 약제를 처리하여 감수성 여부를 조사하였고, 점박이응애 살비제 저항성 집단과 감수성 집단을 2D-PAGE와 MALDI-TOF/TOF를 실시하여 단백질 합성 패턴을 분석하였다.

본 연구에서 2020년 채집한 국내 7개 지역 점박이응애에 대해 6개의 살비제를 처리하여 감수성 여부를 조사한 결과, 모든 지역의 알은 PT2 집단이 pyflubumide에 2,329배의 저항성을 보인 것을 제외하고etoxazole(>125,000), fenpropathrin(>136.8), pyflubumide(>3703.7), 그리고 pyridaben(>27397.3)에 대해 높은 수준의 저항성이 나타났다. 성충에 대한 처리 약제 3개 중 abamectin의 경우 PT2 집단이 371.4배로 7개 집단 중 가장 높은 저항성비가 확인되었으며, GJ, HS, SJ, 그리고 OC 집단은 100배 미만의 보통에서 낮은 수준의 저항성비가 확인되었다. Bifenazate의 경우 PT1 집단이 가장 높은 저항성비가 확인되었으며, HS과 SJ 집단은 비교적 낮은 저항성비를 나타냈다. Pyflubumide의 경우, PT1과 GJ 집단에서 각각 1,364.7배와 561.5배의 저항성비가 확인되었으며, 이외의 5개 집단에서 >1,818.2배의 높은 수준의 저항성비가 확인되었다. 이처럼 저항성비를 통한 감수성 평가 결과, 야외에서 채집된 7개의 집단이 모두 복합저항성을 가졌을 것으로 판단되었으며, PT1과 PT2 집단이 비교적 높은 저항성 수준을 보였으므로 집단 중 가장 복합적인 저항성을 가지고 있을 것으로 보였다.

야외 채집 점박이응애는 여러 종류의 약제에 노출됐을 가능성이 크므로 교차저항성 및 복합저항성을 보인다. 절지동물에서는 크게 두 가지의 살비제 저항성 메커니즘이 알려져 있는데 첫째는 주요 해독 효소의 양적 또는 질적 변화로 인한 노출 감소와, 두번째로 점 돌연변이에 의해 유발된 표적부위 변화로 인한 감수성 감소이다. 앞서 우리가 보고한 바와 같이(Shin et al., 2021), 약제 저항성 수준과 점 돌연변이의 발생은 종종 일관성이 있다. 따라서 7개의 야외 집단에서 bifenazate, etoxazole, 그리고 pyridaben에 대한 살란효과, 살비효과 그리고 점 돌연변이 간의 상관관계를 조사한 결과 etoxazole과 pyridaben 간의 상관관계는 우리가 이전에 보고한 결과와 일치했다(Koo et al., 2021a). 그러나 abamectin, fenpropathrin, 그리고 pyflubumide에 저항성을 가진 집단에서 점 돌연변이 검출 만으로 저항성 진단 마커로 사용하기에는 적합하지 않았다. 즉, 약제마다 상관관계에 차이가 있음을 알 수 있었다.

본 연구에서 우리는 점박이응애의 알려진 약제 저항성 기작 외 다른 기작을 밝히기 위해 단백질 합성의 변화에 초점을 맞췄다. 단백질체 연구는 세포에 스트레스가 가해진 후 내부에서 어떤 일이 일어나는지를 이해하는 데 도움을 준다. Koo 등(2021b)은 훈증제로 잘 알려진 포스핀(PH₃)에 감수성인 쌀바구미(Sitophilus oryzae)와 저항성인 쌀바구미에서 단백질을 추출하여 전체 단백질체 프로파일을 비교 분석했다. 이 연구를 통해 PH₃-저항성 쌀바구미에서 일부 단백질들이 높게 발현되거나 또는 낮게 발현되는 것을 밝혀냈다. 특히, cytochrome oxidase subunit I은 PH₃-저항성 쌀바구미에서 감수성보다 15배 높은 발현을 보였다. 또한 citrate synthase 2, delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase, 그리고 triose-phosphate isomerase 합성도 증가됐음을 알 수 있었다. PH₃의 작용 메커니즘은 세포 내 대사와 산화적 스트레스를 방해하는 것에서부터 신경 독성에 이르기까지 다양하다. PH₃-저항성은 유전이 되며 미토콘드리아 dihydrolipoamide dehydrogenase complex에 의해 매개된다(Chaudhry and Price, 1990). 비록 더 많은 단백질을 동정하지는 못했지만 PH₃ 작용기작에 관련된 몇몇 단백질의 합성정도를 밝혀낸 의미있는 연구였다. 본 연구의 야외 채집 점박이응애에서 추출된 단백질 중 적게는 32.1배(aldose reductase)에서 많게는 301.5배(elongation factor-1 beta)의 단백질 합성이 증가된 것을 관찰하였다. 32.6배의 증가를 보인 HSP30D는 여러 환경적 스트레스 하에서 유발되는 heat shock protein으로 ATPase를 억제하여 에너지 보존에 관여한다(Piper et al., 1997). 또한 HSP70으로 잘 알려진 ER chaperone BiP는 야외 채집 집단에서 44.8배 증가한 것으로 나타났다. Heat shock protein은 외부로부터의 충격에 의해 발현이 증가되며 증가된 단백질은 그 충격을 극복하려 작용한다. 약제저항성 점박이응애에서 heat shock protein의 합성 증가와 그 기능에 대해서는 추가적인 실험이 필요하다. 반대로, proteasome subunit beta type-2는 0.36배로 감소했다. 이 단백질은 20S 단백질분해효소 복합체의 완전한 조립에 기여하는 17개의 필수 subunit 중 하나이다. 특히, proteasome subunit beta type-2는 다른 beta subunit과 함께 두 개의 heptameric ring을 형성하고, 그 후 기질 분해를 위한 proteolytic chamber로 조립된다. 진핵생물의 단백질분해효소는 손상된 단백질 등 분해 가능한 단백질을 인식하여 단백질 품질 관리를 위한 목적으로 또는 동적인 생물학적 과정의 핵심 조절 단백질 성분을 위해 작용한다. 실질적으로 이러한 단백질들이 점박이응애 약제저항성 기작에 기여하는지는 추가적인 연구가 필요한 실정이다. 또한 대상으로 한 45개 시료 중 20여개는 동정이 되지 않았는데, 점박이응애의 전체 단백질 데이터 부족에 기인한 것이다. 전기영동상의 등전점 즉 pI와 분자량의 관측값과 이론값은 항상 일치하지 않으며 이는 아마도 post-translational modifications, isoforms, 또는 점박이응애 단백질과 그 동종 단백질 간의 차이로 인한 것일 수 있다.

결론적으로 본 연구에서는 국내 분포하는 점박이응애가 다양한 약제에 대해 저항성이 있다는 것이 확인되었다. 따라서 살비제를 적용할 때는 그 약제에 대해 저항성이 발달했는지 먼저 확인하고, 저항성이 발달한 살비제나 이와 유사한 작용기작을 가진 약제는 피해야 하며, 효과적인 살비제를 교대로 분무하는 것이 필요하다. 또한 우리가 밝힌 약제 저항성 야외 채집 집단에서의 단백질 발현 수준이 살비제 저항성 기작에 관여하고 있다고 추측은 되지만 직접적인 증거는 없는 실정이다. 따라서 살비제 저항성 점박이응애에서 이러한 단백질들을 분자적 진단 마커로 사용하기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다.