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청주시 옥산면 애호박 시설재배지에서 2025년 1월 말에 정식한 지 40일이 경과한 애호박 유묘(내사랑 애호박, 농우종묘)에 굵은 뿌리(5 mm 이상) 및 미세뿌리(5 mm 이하)에서 특이적인 뿌리혹 증상이 관찰되었다(Fig. 1). 애호박 유묘는 공주 소재 육묘장에서 25^oC 내외의 온도와 70~80% 습도 및 충분한 광량과 환기가 되는 환경에서 3주간 육묘된 묘를 사용하였고 본엽이 3~4매 전개된 시기에 시설재배지에 정식되었다. 병원균 분리를 위해 병든 뿌리의 미세뿌리가 떨어지지 않도록 조심스럽게 채집한 후, 크기가 작은(5.0 × 5.0 mm) 뿌리혹 3~4개를 잘라내어 사용하였다. 그리고 애호박 재배지에서 2024년 12월에 수집한 뿌리혹병 이병물 가운데 병징이 확인된 것을 골라내어 병원균 분리에 사용하였다. 뿌리혹병 병징이 확인된 병든 뿌리는 70% 에탄올을 사용하여 표면소독을 실시한 후 멸균증류수로 세척하고 표면의 수분을 완전하게 건조하였다. 이후 표면살균된 뿌리혹에 멸균수 1.0 ml를 첨가하여 멸균한 유리봉으로 완전하게 균질화하여 뿌리혹에 있는 세균을 추출하였다. 그 다음 멸균증류수 900 µl가 채워진 튜브에 뿌리혹 추출액 100 µl를 혼합하여 단계희석하고 병원균 분리에 사용하였다. 뿌리혹병균 분리는 1A 선택배지 [L(−) arabitol 3.04 g, NH₄ NO₃ 0.16 g, KH₂ PO₄ 0.54 g, K₂ HPO₄ 01.04 g, Sodium taurocholate 0.29 g, MgSO₄·7H₂O 0.25 g, Agar 15 g/L, 멸균이후 50^oC 정도에 2% cycloheximide 수용액 1.0 ml, 1% Na₂SeO₃ 6.6 ml 첨가]를 이용하였다(Brisbane and Kerr 1983). 1A 선택배지에 단계희석한 뿌리혹 세균 추출액 100 µl을 도말하여 28^oC 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세균 중 균총 주변에 흰색의 엷은 띠를 가진 콜로니를 선택하여 TSA(Trypticase Soy Agar; Difco, USA) 배지에서 동일한 조건으로 배양하며 단일 콜로니를 분리하였다. 그 후 순수 분리된 뿌리혹병 8개 균주는 10% 글리세롤 용액에 혼합하여 -80^oC 초저온냉동고에서 보존하며 실험에 사용하였다.

Fig. 1. 
Typical symptom of root gall disease collected from squash farm at cheongju area in 2025. Small root galls are attached to the fine root in the early growing stage(A,B) and irreguarly grown root gall symptom(C) were observed on root collected after harvest.

농용 항생제 반응조사는 TSA 배지를 60^oC 정도로 식힌 다음 농약의 안전사용기준 농도에 따라서 희석배지를 제조하여 사용하였다. 실험에 사용한 농용 항생제 농약은 시판 중인 옥시테트라사이클린(AI 34%), 스트렙토마이신(AI 20%), 가스가마이신(AI 10%), 옥솔린산(AI 20%), 동수화제(AI 77%)로 5종 이었다. 각 농약별로 안전사용기준의 추천농도를 조절하여 옥시테트라사이클린 170 µg/ml, 스트렙토마이신 200 µg/ml, 가스가마이신 100 µg/ml, 옥솔린산 200 µg/ml, 동수화제 770 µg/ml의 농용 항생제 희석배지를 제조하였다(Table 1). 그리고 애호박 뿌리혹에서 순수 분리한 병원세균 한 루프(loop) 균총을 튜브에 멸균수로 희석하여 세균농도가 107 cfu/ml가 되도록 조절하여 농용 항생제 농약이 혼합처리된 희석배지에 100 µl씩 접종하여 충분히 도말하였다. 처리는 3반복으로 진행하였고 28^oC에서 48시간 배양하고 나타난 균총수를 조사하여 농용 항생제 반응으로 평가하였다.

항생제 최소억제농도 조사는 2025년 3월에 애호박 뿌리혹병 발생 지역에서 분리한 병원균 7 균주를 이용하였다. 그리고 애호박 뿌리혹병균(A. tumefaciens)의 스트렙토마이신과 테트라사이클린에 대한 MIC 분석은 E-test 스트립(Biomerieux France)을 사용하여 수행하였다(Bolmström et al., 2007). MIC 측정용 E-test 스트립의 스트렙토마이신 농도는 0.064~1,024 µg/ml, 테트라사이클린 농도는 0.016~256 µg/ml로 처리되었다. 애호박 뿌리에서 순수 분리한 A. tumefaciens는 TSA 배지에 획선 도말하여 28^oC에서 48시간 동안 배양하였다. 그리고 신선한 병원균 콜로니 한개를 멸균한 loop로 취하여 멸균증류수 1.0 ml 플라스틱 튜브에 풀어 교반기로 충분히 섞어 주었다. 그 후 병원균 현탁액 100 µl를 취하여 TSA 배지에 유리봉을 이용하여 충분하게 도말하여 5분정도 경과한 다음 E-test 스트립을 핀셋으로 페트리디쉬 중앙에 놓고 24시간동안 28^oC 항온기에서 배양하였다. 항생제에 의한 병원균의 최소 억제농도는 억제대가 만나는 지점의 농도를 판정하며 2개의 농도사이에 억제대가 있으면 높은 농도로 판독하였다.

세균병 방제용 농약으로 국내에 등록된 옥시테트라사이클린(AI 34%)의 뿌리혹병균 억제농도를 조사하기 위하여 2025년 3월에 애호박 뿌리혹병 발생 지역에서 분리한 병원균 7 균주를 이용하였고, 추천농도(170 µg/ml), 1/2(85 µg/ml), 1/4(42.5 µg/ml), 1/10(17 µg/ml) 수준으로 농용 항생제 희석배지를 제조하였다. 그리고 앞에서 언급한 것과 동일한 방법으로 애호박 뿌리혹병균을 100 µl씩 옥시테트라사이클린 희석배지에 도말 접종하여 세균집락 형성 여부로 병원균의 최소억제농도를 조사하였다.

청주시 소재 애호박 시설재배지에서 2024년 최초로 뿌리혹병 발생보고 이후(Park et al., 2024) 2025년 1월 말에 애호박 유묘를 정식한지 약 40일이 지난 지하부 어린 뿌리에서 콩알 크기의 혹이 다양하게 확인되었다(Fig. 1). 그리고 어린 뿌리혹 증상을 수집하여 선택배지를 이용하여 병원균 12 균주를 분리하였다. 그동안 애호박 재배농가는 뿌리에 발생하는 특이적 혹병 증상의 원인을 선충으로 진단하고 선충 농약을 재배과정에 반복적으로 처리하고 있었다(내역 미공개). 그러나 애호박 재배중에 뿌리에 발생하는 혹병 증상은 A. tumefaciens 가 원인으로 선충방제 농약처리 효과가 나타나지 않았다.

애호박 뿌리에서 분리한 병원균 12 균주는 배지희석법으로 처리한 5종의 농용 항생제 반응이 다양하게 나타났다(Table 2). 스트렙토마이신 농약은 200 µg/ml 농도에서 무처리와 비슷한 수준으로 병원균 콜로니가 왕성하게 형성되었으나 옥시테트라사이클린은 170 µg/ml 농도에서 병원균 콜로니가 전혀 형성되지 않았다. 그리고 옥솔린산, 가스가마이신, 동수화제는 일부 병원균의 콜로니 생성 억제효과가 있으나 균주 간 차이가 있고 일관성 있는 결과를 얻지 못하였다. 특히, 애호박 뿌리혹병은 2024년에 최초로 발병이 확인된 것으로 국내에 등록된 농약이 없음에도 불구하고 농용 항생제 반응이 다양한 것은 추가적인 연구가 필요하였다.

그러나 옥시테트라사이클린에 의한 애호박 뿌리혹병균의 콜로니 생성억제효과는 희석배지법을 통하여 뚜렷하게 확인되었다. 본 연구 결과를 활용한 현장적용을 위해 애호박 재배에 부합하는 시험연구를 수행한다면 방제를 위한 농약 등록 가능성이 높을 것으로 판단된다.

애호박 뿌리혹병균은 스트렙토마이신과 테트라사이클린에 대한 최소억제농도는 큰 차이를 보였다(Table 3). 뿌리혹병균은 스트렙토마이신의 최소억제농도가 4.0~1,024 µg/ml으로 균주 간 큰 차이를 보이며 저항성 반응을 보였다. 특히, 분리균주 C-1-1은 1,024 µg/ml 농도에서도 생장억제가 일어나지 않았기에 저항성 유발 원인에 대한 구체적인 후속 연구가 필요하다. 반면, 테트라사이클린은 최소억제농도가 0.5~1.5 µg/ml으로 균주 간 차이 없이 일정한 감수성 반응을 보였다.

다른 작물에서 보고된 E-test에 의한 항생제 저항성 사례를 고려할 때, 배추 재배지에서 분리한 검은썩음병균(XCCSmR)은 1,024 µg/ml의 고농도 스트렙토마이신에도 억제되지 않아 강한 저항성을 나타낸 바 있으며(Lee et al., 2023), 무름병균의 경우에도 2000년대에 분리균의 3.04 µg/ml 보다 2021년 분리균이 6.64 µg/ml로 최소억제농도가 약 2배 증가한 것이 보고되었다(Kim et al., 2021). 이러한 사례는 특정 항생제의 단독‧반복 사용이 장기적으로는 방제 효과를 저하시킬수 있음을 시사한다.

국내에 등록된 농용 항생제 중 테트라사이클린을 주성분으로 하는 농약이 없으나 동일계열에 속하는 옥시테트라사이클린을 주성분으로 하는 농약이 다수 등록되어 이를 대상으로 억제농도 조사를 위한 실험을 추가적으로 실시하였다.

애호박 뿌리혹병균에 대한 옥시테트라사이클린의 효과를 조사한 결과, 표준사용량 170 µg/ml의 1/10 수준인 17 µg/ml 농도에서 병원균의 생장이 완전히 억제되는 것을 확인하였다(Table 4). 이는 뿌리혹병균이 옥시테트라사이클린에 대해 높은 민감성을 보이며, 비교적 낮은 농도에서도 효과적인 억제력이 나타난다는 것을 의미한다. 따라서 테트라사이클린계 농용 항생제는 애호박 뿌리혹병 방제에 실질적으로 활용 가능성이 높은 약제로 판단된다.

국내에는 세균병 방제를 위하여 스트렙토마이신, 옥시테트라사이클린, 옥솔린산, 가스가마이신, 발라다마이신 및 동수화제가 등록되어 다양한 작물에서 오랫동안 사용되어 왔다(RDA, 2025). 현재까지 국내에서 화상병 및 가지검은마름병 발생지에서 분리된 Erwina amylovora는 스트렙토마이신, 옥시테트라사이클린과 옥솔린산에 대하여 저항성 반응이 없다고 보고하였다(Ham et al., 2023).

한편, 국내 복숭아 과원 농용 항생제 농약 사용실태 분석 결과에 따르면 조사대상 농가는 세균구멍병 방제에 농약을 7.7회 살포한다고 하였다. 주요 농용 항생제는 스트렙토마이신, 옥솔린산, 발리다마이신 옥시테트라사이클린으로 4종의 단위면적당 주성분 사용량은 큰 차이가 없으며 교호살포로 저항성 발현에 대한 관리를 하고 있다고 하였으나 약제성분 수가 적어 한계를 드러낼 것이라 하였다(Ryu et al., 2023).

해외에서 옥시테트라사이클린은 스트렙토마이신에 대한 저항성이 보고된 화상병균(E. amylovora)의 방제를 위해 주로 사용되고 있으나(Verhaegen et al., 2023), 최근 California에서 화상병균(E. amylovora)에 옥시테트라사이클린과 스트렙토마이신에 저항성 유전자가 보고되었고(Sundin et al., 2023), South Carolina의 복숭아 과원에서 세균구멍병(Xanthomonas arboricola pv. pruni)에 7개의 옥시테트라사이클린과 스트렙토마이신 저항성 유전자가 보고 되었는데 일부균주는 250 µg/ml에서도 생장이 가능하였다(Herbert et al., 2022).

최근에는 작물에 발생하는 혹병균이 농용 항생제에 의한 화학적 방제만으로는 지속적인 효과를 기대하기 어렵기 때문에 생물학적 방제법이 다양하게 제시되고 있다. 그 중에 내생세균이 생산하는 휘발성 유기화합물을 이용하는 경우 혹병균의 병원성을 약화시키고 기주의 저항성을 증가시킨다고 하였고 Bacillus amyloliqifaciens strain 32a가 생산하는 lipopeptide가 혹병 방제에 효과적이라는 보고가 있었다(Abdallah et al., 2015). 따라서 본 연구에서 제시된 농용 항생제의 신규약제 등록과 더불어, 생물방제용 연구를 통하여 현장적용 효과를 높이는 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.