Current Issue

2021년과 2022년 태백, 괴산 등 배추 재배지에서 무름증상과 검은썩음병의 병징이 보이는 시료를 수집한 GPS 정보는 Table 1과 같다. 병원균을 분리하기 위하여 이병시료를 흐르는 수돗물로 세척한 후 물기를 제거하고, 이병부위의 시료를 채취하여 1% 차아염소산나트륨 70% 에탄올로 표면을 소독한 후, 멸균수로 세척하였다. 표면소독 한 시료에서 물기를 제거한 후 500 μl 멸균수와 비즈가 담긴 튜브에 넣고 30분간 방치하였다. Taco Prep Bead Beater (GeneReach, Taiwan)를 이용하여 마쇄한 후 마쇄액 10 μl를 이용하여 Tryptic soy agar (TSA, Difco)에 획선 도말한 후, 25^oC에 배양하였고, 단일 균총을 취하여 균을 순수분리 하였다. 또한 실험에 활용하기 위한 대조균주로서 배추무름병균 P. carotovorum 2균주(KACC 18645, KACC 22674), P. brasiliense 2균주(KACC 22675, KACC 22678), P. odorifeum 1균주(KACC 22680), P. versatile 1균주(KACC 22669), 검은썩음병균 Xanthomonas campestris pv. campestris 6균주(KACC 10377, KACC 17966, KACC 19132, KACC 19135, KACC 19136), Xanthomonas속 2종 2균주(KACC 14864, KACC 11139)를 국립농업과학원 농업미생물은행(KACC)에서 분양 받았다.

병원균을 동정하기 위하여 순수분리한 23개의 균주로부터 DNA 추출 키트(Plant DNA extraction kit, Qiagen)를 사용하여 DNA를 분리하였다. 무름병균의 정확한 동정을 위한 mutilocus sequencing analysis (MLSA)를 실시하기 위해 Aconitate hydrase1 (acnA), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase A (gapA), Isocitrate dehydrogenase, specific for NADP+ (icdA), Malate dehydrogenase (mdh), Mannitol-1-phosphate dehydrogenase (mtlD), Glucose-6-phosphate isomerase (pgi), Gamma-glutamylphosphate reductase (proA) 유전자의 염기서열을 확보하였다(Ma et al., 2007). 각 유전자 증폭은 Table 3의 프라이머를 이용하였고 PCR 조건은 Ma et al. (2007)에 기술된 방법에 따라 실시하였다. 7개의 유전자의 염기서열을 순서대로 붙여 총 3,118 bp의 서열을 대상으로 계통수를 작성하였다. 검은썩음병균은 16S rRNA를 518F (5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3'), 800R (5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3') 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하고 염기서열을 확보하였다(Sanko et al., 2018). 확보된 염기서열을 이용하여 MEGA version 7.0.26에서 Maximum Likelihood Tree로 Bootstrap 횟수를 1,000반복으로 설정하고 Juke-Cantor model로 선택하여 계통수를 작성하였다.

병원균의 스트렙토마이신 저항성 검정을 위하여 TSA 배지에 스트렙토마이신 100 μg/ml을 첨가하여 제조하였다. 수집한 균주는 스트렙토마이신 100 μg/ml이 첨가된 배지에 평판 도말하여 저항성 균주를 선발하였고, 농업미생물은행에서 분양받은 균주는 획선도말하여 저항성 여부를 검정하였다.

총 23개 균주를 대상으로 스트렙토마이신 저항성을 검정한 결과, 괴산에서 분리된 MHXcc2101 1개 균주가 저항성인 것으로 나타났다. 이 균주의 저항성 발현기작을 분석하기 위해 DNA 추출 키트(Plant DNA extraction kit, Qiagen)를 사용하여 DNA를 분리하였다. strA와 strB 유전자와 rpsL 유전자 부위의 염기서열 변이를 분석하기 위하여 Table 4의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였고, PCR 조건은 Sharma et al. (2022)에 기술된 방법에 따라 실시하였다. PCR 산물 5 μl를 1% 아가로스겔에 로딩하여 PCR 증폭산물을 확인하였다.

TSA에 배양된 스트렙토마이신 저항성 균주의 균총을 멸균수 5ml에 현탁하여 OD₆₀₀을 0.1로 조정한 세균 현탁액 100 μl를 취하여 TSA 배지에 평판 도말하였다. 평판 도말한 배지에 스트렙토마이신(0.064~1,024 μg/ml)이 농도별로 처리된 E-test (Biomerieux) 스트립을 배지에 올려놓고 28^oC에서 24시간 배양하였다. 대조균으로 스트렙토마이신 감수성 균주인 X. campestris pv. campestris (KACC 10377)과 비교하였다. 또한 저항성 균주의 최소억제농도(MIC, minimal inhibition concentration)를 확인하기 위하여 저항성 균주를 평판 도말한 후 스트렙토마이신 0, 1, 5, 100, 500, 1,000, 2,500 μg/ml 농도를 8 mm paper disc (Toyo Roshi, Japan)에 올려 스트렙토마이신 반응을 조사하였다.

태백, 해남, 괴산, 완주, 김제에서 수집한 이병시료에서 병원균을 분리한 결과, 총 19개의 Pectobacterium균과 4개의 Xanthomonas균이 분리되었다. Pectobacterium균은 Brenneria속과 Dickeya속을 포함하여 MLSA 분석과 계통수 작성을 통해 P. carotovorum, P. brasiliense 2종으로 동정하였다(Fig. 1). 대표균주 P. carotovorum 1종(GenBank: LC782010)과 P. brasiliense 2종(GenBank: LC645699, LC685064)의 16S rRNA 염기서열을 NCBI 데이터베이스에 등록하였다. Pectobacterium속은 Brenneria속, Dickeya속과 계통적으로 거리가 멀고, 종 단위로 그룹핑되는 것을 확인할 수 있다(Fig. 1). Jee et al. (2020) 등에 의하면 국내 배추재배지에서는 5종이 병을 일으키는 것으로 알려져 있으나 이번 조사에서 분리한 균주에서는 P. odoriferum, P. aroidearum, P. versatile는 분리되지 않았다. 고랭지 지역인 태백에서 분리한 균주는 모두 P. carotovorum이였으며 해남 지역에서는 P. carotovorum과 P. brasiliense 두 종이 함께 분리되었다. 시료 수집 연도가 짧고 균주 수가 많지 않아 지역별 우점 병원균은 명확하지 않으나 지속적인 조사가 이루어진다면 지역별 우점종을 알 수 있을 것으로 사료된다. 태백, 괴산지역에서 분리한 검은썩음병균 4개 균주는 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 계통수를 작성한 결과 Xanthomonas campestris pv. campestris로 동정되었다(Fig. 2). 채집 당시 시료는 병반 부위에 무름병 등의 2차 감염은 없었으며 병원균 분리 시 검은썩음병 이외의 병원균은 분리되지 않았다. 분리한 균주를 배추 유묘에 접종한 결과, 모두 병원성이 있는 것으로 확인되었다(데이터 미제시). 국내의 경우, 배추 검은썩음병에 대한 연구가 매우 적어 발생현황, 병원균의 특성 등에 대한 연구가 미진하다.

Fig. 1. 
Phylogenetic analysis of Pectobacterium strains based on sequences of acnA, gapA, icdA, mdh, mtlD, pgi, and proA. DNA sequences sourced from the NCBI database were aligned using ClustalW and phylogenetic trees were constructed and visualized using the maximum likelihood and MEGA7, respectively.

Fig. 2. 
Phylogenetic analysis of Xanthomonas campestris pv. campestris and Xanthomonas spp. based on sequences of 16S rRNA. DNA sequences sourced from the NCBI database were aligned using ClustalW and phylogenetic trees were constructed and visualized using the maximum likelihood and MEGA7, respectively.

무름병균과 검은썩음병균의 스트렙토마이신 저항성을 검정한 결과, 무름병균에서는 저항성을 갖는 균주가 분리되지 않았으나 괴산에서 분리한 검은썩음병균(XCCSmR) 1균주가 스트렙토마이신 저항성인 것으로 확인되었다(Table 2). 대조균으로 사용된 국립농업과학원 농업미생물은행(KACC) 균주는 모두 스트렙토마이신 감수성으로 확인되었다. 저항성을 나타낸 검은썩음병균(XCCSmR)을 스트렙토마이신이 농도별로 코팅되어 있는 E-test 스트립 테스트를 한 결과, 감수성 균주인 KACC10377는 최소억제농도가 3 μg/ml 인 것에 비해 저항성 균주는 1,024 μg/ml에서도 저지환이 형성되지 않아 스트렙토마이신에 저항성임을 다시 확인하였다(Fig. 3C). 저항성 균주(XCCSmR)를 배추 유묘 5주에 3반복으로 접종한 결과, 감수성 균주와 비교하여 병원성에 차이는 없는 것으로 나타났다(Fig. 3B).

Fig. 3. 
A, Polymerase chain reaction (PCR) detection of the rpsL and strA and strB. Lane M: 1-kb ladder. N: Negative control. S: XCCSmR; B, Pathogenicity assay in kimchi cabbage inoculated with KACC10377 and XccSmR. KACC10377 and XccSmR produced similar symptoms in kimchi cabbage at 14 days postinoculation. C-D, Inhibitory effect of streptomycin on the growth of KACC10377 and XCCSmR, assessed using the E-test strip (C) and the paper-disc method (D). Streptomycin concentration: 0 - 2,500 μg/ml.

본 연구에서 수집한 배추무름병균은 스트렙토마이신 저항성인 균주가 없었으나, 이전 연구에서는 배추, 무에서 분리한 76개의 무름병 균주 중 5개 균주가 스트렙토마이신 저항성인 것으로 조사된 바 있다(Kim et al., 2021). 현재 국내에는 배추 검은썩음병 방제를 위해 등록된 약제는 없으나, 스트렙토마이신이 함유된 살균제가 배추 무름병 방제에 사용되고 있다. Stall and Thayer (1962)에 연구에 의해 스트렙토마이신 저항성 세균점무늬병균(X. campestris pv. vesicatoria)의 발생이 처음 보고되었으며, 이 후 Xu et al. (2013)에 의해 벼 흰잎마름병균(X. oryzae pv. oryzae)의 스트렙토마이신 저항성균주가 보고되었다. 본 연구에서 분리된 저항성 검은썩음병균의 경우, 배추 재배지에서 무름병 방제를 위해 스트렙토마이신 등의 약제 살포가 빈번히 이루어진 것이 저항성균이 출현한 원인으로 생각되며, 향후 여러 지역과 포장에서 검은썩음병균을 분리하여 저항성을 모니터링할 필요가 있다.

배추에서 분리한 스트렙토마이신 저항성 균주의 strA와 strB 유전자의 삽입 여부를 확인한 결과, 두 유전자의 삽입은 확인되지 않았다(Fig. 3A). 따라서 또 다른 기작 중 하나인 rpsL 유전자의 염기서열을 분석한 결과 88번 아미노산 부위에서 라이신(AAG)이 아르기닌(AGG)으로 변이가 발생한 것을 확인하였다(Table 5). Xanthomonas속의 스트렙토마이신 저항성균주는 rpsL 유전자의 단일염기변이에 의해 43번 또는 88번 아미노산이 치환되면서 저항성을 획득하는 것으로 알려져 있다(Zhang et al., 2015). 따라서 본 연구에서 분리된 스트렙토마이신 저항성 검은썩음병균(XccSmR)은 strA와 strB 유전자의 삽입이 없고, rpsL 유전자의 88번 아미노산이 치환되면서 저항성을 획득한 것으로 나타났다. 본 저항성 균주의 최소 억제농도를 확인한 결과, 스트렙토마이신 2,500 μg/ml 이상에서도 억제되지 않는 것으로 나타났다(Fig. 3D). 기존 연구에 의하면 rpsL 유전자의 염기서열 변이에 의해 스트렙토마이신 저항성을 획득한 E. amylovora 등의 병원균 역시 MIC 농도가 2,000 μg/ml 이상인 것으로 보고되었다(Chiou and Jones 1995; McManus et al., 2002). 향후 국내 균주의 MIC 농도를 구하기 위해서 더 높은 농도에서의 조사가 필요할 것으로 생각된다.

본 연구에서는 국내 배추 재배지에서 분리한 검은썩음병균의 스트렙토마이신 저항성균을 국내에서 처음으로 분리하였고, 게놈 내 단일염기변이를 확인하였다. 이는 배추 무름병 방제를 위한 지속적인 항생제의 살포가 방제 대상 병원균인 무름병뿐만 아니라 검은썩음병균이 항생제 저항성 획득할 수 있다는 가능성을 나타낸다. 따라서 배추 무름병의 방제를 위해 사용하는 항생제를 계통별로 교호 살포하고, 무름병 뿐만 아니라 검은썩음병, 세균검은무늬병 등의 세균병을 대상으로 항생제 저항성 모니터링을 지속적으로 실시하며, 효과적인 미생물 제제의 개발을 추진하는 등 항생제 저항성 관리를 위한 종합적 대책 마련이 필요할 것으로 판단된다.