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시험에 사용한 acacetin, apigenin, 3-carene, coumestrol, linalool, thymol은 TCI (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Japan)에서 구매하였고 capsaicin, gallic acid, geranyl acetate, luteolin, nicotinamide, o-vanillin, sinapic acid, stigmasterol, tropine, dimethylsulofoxide (DMSO)는 Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA)에서 구매하였으며, geraniol은 Alfa Aesar (Alfa Aesar Co., Inc, USA) 제품을 사용하였다. 정유 분석에 사용한 acetone은 Burdick & Jackson^TM (Honeywell International Inc, Morris Plains, NJ, USA)의 high-performance liquid chromatography (HPLC) grade를 사용하였다.

식물정유 중 주성분 분석은 Kim et al. (2023)의 방법에 따라 수행되었고, total ion chromatogram (TIC) 검출법을 통해 물질의 정성확인을 거친 후 selected ion mode (SIM) 검출을 통해 0.1% 이상 함유성분에 대해 정량 분석하였다.

시험에 사용한 균주인 X. campestris pv. vesicatoria는 전남바이오산업진흥원 친환경농생명연구센터(JBF, Jeollanam-do, Korea)로부터 분양 받아 사용하였다. 시험균주는 Luria-Bertani (LB) broth (Difco^TM LB Broth, Miller, BD, Frannklin Lakes, NJ, USA)에 접종하고 30^oC에서 48시간 동안 진탕배양기에서 배양하며, 항세균활성 시험균주의 농도는 약 1 × 10⁸ cfu mL^-1이었다.

시험에 사용된 15종의 monoterpenoid 및 phenolics는 DMSO로 2배씩 점진적으로 희석하였다. 96 well-plate에 균주배양액 10μL를 185μL의 멸균 LB 배지에 접종하고, DMSO에 녹여진 15종의 천연물질을 각각 5 μL를 첨가한 후, 시료가 처리된 배양액을 30^oC에서 48시간 incubator에서 배양하였다. X. campestris가 성장하지 않은 처리구를 최소저해농도(minimum inhibition concentration, MIC)로 측정하였다.

X. campestris에 대한 항세균활성이 확인된 물질간의 synergistic effect는 Kim 등(2023)의 방법에 따라, 분할저해농도(fractional inhibitory concentrarion, FIC) 지수로 평가하였다. 각 물질의 농도가 MIC 이하가 되도록 혼합한 후 균주배양액(약 1 × 10⁸ cfu mL^-1)에 처리하고, 균이 생장하지 않는 처리구를 대상으로 FIC index를 아래의 식에 따라 산출하였다.

• FIC index = Σ (FIC_A + FIC_B + FIC_C ...)
• FIC_A = MIC_A+B+C... / MIC_A, FIC_B = MIC_A+B+C... / MIC_B,
• FIC_C = MIC_A+B+C... / MIC_C

FIC index는 Kim 등(2023)이 구분한 방법에 따라, synergistic effect (FIC index ≤ 0.5), additive effect (0.5 ≤ FIC index ≤ 1), indifferent effect (1 ≤ FIC index ≤ 4), antagonistic effect (FIC index ≥ 4)로 구분하였다.

식물정유의 주성분으로 알려진 15종의 terpenes 및 phenolics를 대상으로 X. campestris에 대한 항세균활성을 평가하였으며, 그 중 thymol, geraniol, o-vanillin에서 최소저해농도(minimal inhibition concentration, MIC)가 각각 125 μg mL^-1, 250 μg mL^-1 와 250 μg mL^-1로 우수한 항세균활성을 확인할 수 있었다(Table 1).

Geraniol, thymol, o-vanillin은 palmarosa oil, thyme oil 그리고, Helichrysum oligocephalum정유의 주성분으로 알려져 있으며(Fig. 1), 정유의 주요성분은 Table 2에서 나타낸 바와 같았다. 정유의 주성분에 대한 항세균활성은 다양한 균에서 보고되었으나(Kim et al., 2014; Vujic et al., 2020; Bezek et al., 2022; Kumar et al., 2022), 식물 병원균인 X. campestris에 대해서는 thyme oil의 주성분으로 알려진 thymol (MIC = 195 μg mL^-1)에 대해서만 보고되었다(Hakalova et al., 2022). 문헌자료에 따르면, geraniol을 주성분으로 하는 palmarosa oil은 다양한 균주에 대해 MIC가 80-10,000 μg mL^-1이었고, o-vanillin을 주성분으로 함유한 Helichrysum oligocephalum 정유는 >150 μg mL^-1 수준으로 보고되었다(Vujic et al., 2020; Bezek et al., 2022; Kumar et al., 2022). 따라서, thymol, geraniol, o-vanillin 등을 주성분으로 하는 식물정유 또한 X. campestris에 대한 항세균활성을 기대해 볼 수 있었으며, 이들 중 손쉽게 확보 가능한 thyme oil과 palmarosa oil을 대상으로 X. campestris에 대한 MIC를 측정한 결과 각각 125 μg mL^-1에서 확인되었다. 하지만, thyme oil과 palmarosa oil은 100 μg mL^-1 미만에서 배추 등 식물종자의 발아와 유근생장 억제 등 phytotoxicity 보고가 있었기 때문에(de Almeida et al., 2010; Choi et al., 2015), 이들 식물정유를 직접 병 방제에 활용하기는 어렵다고 판단하였다.

Fig. 1. 
Structure of geraniol, thymol, and o-vanillin.

또한, 개별성분으로서 thymol은 최근 Sreelatha 등(2021)의 연구에서 X. campestris의 cell membrane disruption에 의한 biofilm생성억제가 주요 항균 작용기작으로 보고되었으며, o-vanillin은 진균류인 Cryptococcus neoformans 균에 대한 mitochondria ROS 유도기작이 주요 항진균 작용기작으로 보고된 바 있으나, 세균에 대한 작용기작은 아직 알려진 것이 없다(Kim et al., 2014).

항세균활성이 나타난 3종의 저분자성 천연물질의 혼합에 의한 synergistic effect를 평가하고자 MIC를 기준으로 단계별로 희석한 혼합용액을 사용하여 checkboard analysis를 통해 확인한 FIC index를 Table 3과 같이 산출하였다.

Thymol과 geraniol 혹은 thymol과 o-vanillin을 사용한 경우 FIC index가 0.75까지 낮아지며 additive effect가 확인되었으나, geraniol과 o-vanillin의 경우에는 특별한 synergistic effect가 확인되지 않았다. 특히, additive effect가 확인된 thymol과 o-vanillin 용액에 geraniol의 첨가량이 증가할수록 FIC index 또한 상승하는 것이 확인되어 geraniol을 thymol과 o-vanillin 용액에 첨가하는 것은 synergistic effect와 무관함을 확인할 수 있었다.

본 연구를 통해 상업적 유통이 많으며, 가격이 저렴한 천연물질인 thymol, geraniol, o-vanillin의 X. campestris에 대한 항세균활성을 확인할 수 있었고, 특히 thymol과 geraniol 혹은 thymol과 o-vanillin의 혼합이 약효상승효과가 있음을 확인하였으며, 이를 활용한 검은썩음병 방제제 활용 가능성을 확인할 수 있었다.