Editorial Board

2023년 2월 9일부터 3월 31일까지 경북 영양읍, 청기면, 수비면에 소재한 시설 고추 육묘장에서 월동충을 대상으로 모니터링이 실시되었다. 포획용 트랩으로 황색점착트랩(10 × 7.5 cm, Green Agrotech, Gyungsan, Korea)을 이용하였고, 각 육묘장에 3반복으로 2월 6일에 설치하였고, 조사 기간 매주 수거하였다. 수거된 트랩은 총채벌레류의 밀도 조사를 위해 실험실에서 Kim et al. (2021b)의 종 특이적 형태 형질을 바탕으로 총채벌레를 구분하였다.

경북 안동지역에서 재배되는 대파에 발생한 파총채벌레를 채집하였다(Khan et al., 2022). 사육 환경조건은 온도 25±2^oC, 상대습도 65± 5%, 14 시간 광주기 조건을 유지하였다. 원형 사육 용기(지름 100 mm, 높이 40 mm)에 알부터 성충까지 사육하였으며, 대파(Allium fistulosum)를 유충과 성충의 먹이로 제공하였다.

황색점착트랩에 포획된 총채벌레의 TSWV 보독 여부를 다중 PCR 검정기술을 통하여 진단하였다. 기본적으로 Kim et al. (2022a)의 방법을 이용하였으며, 여기에 파총채벌레의 특이적 프라이머(Table 1)를 추가하여 3종의 총채벌레를 TSWV 진단과 동시에 구분하게 하였다. 이 PCR 분석을 위해 총채벌레 성충 1마리를 점착 트랩에서 헥산을 이용하여 분리한 후 5분간 건조하였다. 건조된 샘플은 QuickExtract DNA Extraction Solution (Bio-search, Hoddesdon, UK)을 이용하여 핵산을 추출하였다. 추출된 핵산은 Supreme RT-PCR premix (Genetbio, Daejeon, Korea)를 이용하여 50^oC에서 30분간 역전사시켰다. 얻어진 cDNA는 다시 95^oC에서 2분간 초기 변성과정 이후 35회 PCR이 95^oC-30초, 55^oC-30초, 72^oC-45초의 온도 주기로 진행되었다. PCR 조성은 추출 핵산 4 μL, 종특이적 프라이머(Table 1) 1 μL, RT-PCR premix 12 μL로 구성되었다. 이러한 일련의 반응 후 72^oC에서 10분 동안 최종 사슬연장을 진행하였다. 이후 1% 아가로즈젤에 전기영동하여 총채벌레 종류와 바이러스 보독 유무를 판명하였다.

TSWV 게놈에 존재하는 N 유전자의 open reading frame (ORF) 서열을 얻기 위해 Kim et al. (2021b)이 제작한 프라이머를 이용하였다. PCR 반응은 초기 열처리(95^oC, 2분) 이후 DNA 변성조건(95^oC, 30초), 프라이머결합조건(52^oC, 30초), 사슬연장조건(72^oC, 1분)의 온도순환을 40회 반복하였다. PCR 증폭물은 PCR2.1 클로닝벡터(Thermo Fisher Scientific Korea)에 삽입하여 Top10 대장균 균주를 통해 클로닝하였다. 배양된 형질전환 대장균에서 재조합 벡터를 추출하여 염기서열 분석에 이용되었다. 염기서열 분석은 M13F와 M13R의 universal 프라이머를 이용하여 양방향으로 진행되었다(Macrogen, Seoul, Korea). 분석된 DNA 서열들은 Seqman 프로그램(DNAStar, Madison, WI, USA)을 이용하여 N 유전자 서열을 얻었다. 서로 다른 총채벌레에서 유래된 바이러스 N 유전자 서열은 DNAStar의 SeqAlign 프로그램을 이용하여 ClustalW 모드에서 상호 비교되고 이들의 서열 차이를 분석하였다.

TSWV에 감염된 고추로부터 바이러스 RNA 게놈은 Viral Gene-spin Viral DNA/RNA Extraction Kit (Intron, Sungnam, Korea)를 이용하여 추출하였다. 간략하게 기술하면, 감염 고춧잎(지름 0.5 cm 원형 시료)을 1.5 mL 튜브 넣고 500 μL의 용해용 완충용액을 첨가한 후 멸균된 막대로 마쇄하였다. 이후 10분간 상온에서 반응한 후 250 μL 상등액을 얻었다. 여기에 결합용 완충용액을 500 μL를 첨가하고 핵산결합컬럼을 이용하여 추출된 RNA를 모았다. 이를 다시 50 μL의 RNase가 제거된 물을 이용하여 수거하였다. 이렇게 얻은 바이러스 추출물에 대파 잎을 10분간 침지시켰다. 이후 바이러스 감염은 Kim et al. (2023)의 방법에 따라 상온에서 30분 건조한 후 6시간 절식시킨 파총채벌레 1령 유충에 3시간 섭식시켰다. 이후 건전한 먹이로 상기의 사육방법으로 성충까지 발육시켰다.

총채벌레 체내 TSWV의 농도를 측정하기 위해 Kim et al. (2021b)의 방법에 따라 RT-qPCR을 진행하였다. 측정당 100마리의 개체를 하나의 시료로 Trizol RNA 추출키트(Thermo Fisher Scientific Korea, Seoul, Korea)의 제조사 방법을 따라 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 iScript Select cDNA Synthesis Kit (BioRad, Hercules, CA, USA)에 포함된 random primer를 이용하여 프라이머 결합 조건(25^oC, 5분), 역전사(42^oC, 45분) 및 역전사 효소 불활성(85^oC, 5분)을 거쳐서 cDNA를 형성하였다. 바이러스 농도 측정을 바이러스 농도와 qPCR의 Ct 사이에 표준방정식을 우선 결정한다. 이를 위해 TSWV의 N 유전자에 특이적 프라이머 세트(GAGATTCTCAGAATTCCCAGT, AGAGCAATCGTGTCAATTTTATTC)를 이용하여 증폭물을 얻었다. 이 증폭물을 Expin Gel SV (GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 DNA 추출하고 Nanodrop spectrophotometer (Theromo Fisher Scientific Korea)을 이용하여 DNA 정량분석하였다. 상이한 DNA 시료로 희석한 후 Step One Plus Real time PCR system (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)를 이용하여 DNA 양에 따른 상이한 Ct값을 얻어 회귀방정식을 결정하였다. qPCR을 위해서 SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan)에 의해 qPCR이 진행되었다. 곤충 체내 TSWV 농도는 동일한 RTqPCR을 통해 Ct 값을 얻고 이를 통해 상기의 표준방정식을 통해 산출하였다. 바이러스 농도는 virions per thrips로 표시하였다.

총채벌레의 표피를 부드럽게 만들기 위하여 5분간 인산완충용액(PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄)에 침지하였다. 침지된 총채벌레를 곤충핀(No. 1, Shiga, Higashiomi, Japan)을 이용하여 머리와 몸을 분리하여 침샘과 기타 내부장기를 분리하였다. 이후의 모든 과정은 습기를 유지하기 위해서 밀폐용기(Lock and Lock, Seoul, Korea)에서 진행되었다. 분리된 조직을 상온에서 4% 파라포름알데히드(Duksan, Seoul, Korea) 20 μL로 1시간 동안 고정하였다. 이후 PBS를 이용하여 3회 세척한 후 1% Triton X-100 이 포함된 20 μL의 인산완충용액 속에 고정된 충체 시료를 10시간 동안 4^oC에서 처리하였다. 이후 5 % bovine serum albumin (BSA)이 포함된 20 μL의 PBS에서 1시간 동안 상온 처리하였다. TSWV 형광염색을 위해서 TSWV 특이적 항체(1,000배 희석, Agdia, Elkhart, IN, USA)를 5% BSA가 포함된 PBS에 3시간 동안 침지하였다. 세포질을 염색하기 위해서 Rhodamine Phalloidin (1,000배 희석, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 5% BSA가 포함된 PBS로 3시간 동안 실온에서 처리하였다. 핵을 염색하기 위하여 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1,000배 희석, Invitrogen)로 실온에서 3분간 처리되었다. 현미경 사용 시 건조 방지를 위하여 50% 글리세롤(Duksan, Seoul, Korea) 처리 후 커버글래스(18 × 18 mm, Marienfeld, Königshofen, Germany)로 덮어주었다. 시료는 형광현미경(DM2500, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 200배에서 관찰 및 사진 촬영되었다.

처리 효과는 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이용하여 one-way ANOVA 분석을 하였다. 처리 평균간 비교는 LSD 방법을 이용하여 제I형 오류 확률 0.05를 기준으로 판별하였다.

경북 영양에 소재한 4개 고추 육묘장에서 총채벌레가 발생하였다(Fig. 1). 조사기간(2023년 2월 9일부터 3월 31일) 약 7주간 전체 262마리 총채벌레가 포획되었다. 포획된 총채벌레를 형태적으로 동정하면 5마리 미동정 총채벌레를 제외하고 모두 꽃노랑총채벌레, 대만총채벌레 그리고 파총채벌레였다. 특히 2월중에는 거의 모두 꽃노랑총채벌레였으며, 대만총채벌레와 파총채벌레는 3월 이후 발생하였다(Fig. 1A). 포획 개체를 모두 다중 PCR 동정 기술로 총채벌레 종을 재확인과 동시에 TSWV 감염 유무를 분석한 결과 보독 총채벌레는 꽃노랑총채벌레, 대만총채벌레 그리고 파총채벌레에서만 나타났고, 미동정 총채벌레에서는 나타나지 않았다(Fig. 1B). 흥미롭게도 보독률을 비교하여 보면 포획 밀도는 낮지만 파총채벌레에서 가장 높게 나타났다(X²= 12.4; df = 3; P = 0.0060).

Fig. 1. 
Thrips monitoring using yellow sticky traps in nursery farms at Yeonggyang in 2023. (A) Total thrips numbers in different thrips: F. occidentalis (‘Fo’), F. intonsa (‘Fi’), T. tabaci (‘Tt’), and others. (B) Comparison of TSWV-viruliferous rates among different thrips. Figures in the parentheses of the pie chart indicate the numbers of total thrips in each species.

파총채벌레에서 검출된 TSWV가 꽃노랑총채벌레 및 대만총채벌레에서 검출된 TSWV와 유전적 차이를 분석하기 위해 N 유전자를 대상으로 염기서열을 분석하였다(Fig. 2A). 전체 777개 염기서열 가운데 파총채벌레에서 분리된 TSWV는 단 1곳의 염기서열에서 꽃노랑총채벌레 또는 대만총채벌레에서 유래된 TSWV와 차이를 나타냈다. 이러한 염기서열 변화는 아미노산 서열에서도 차이를 주었다(Fig. 2B).

Fig. 2. 
Sequence (A for DNA and B for protein) alignment of N gene (777 nucleotides and 258 amino acids, respectively) encoded in TSWV genomes isolated from three thrips: F. occidentalis (‘Fo’), F. intonsa (‘Fi’), and T. tabaci (‘Tt’). Shaded boxes indicate single nucleotide polymorphic sites.

TSWV에 보독된 파총채벌레가 체내 감염 및 증식 가능성을 분석하기 위해 실내 접종실험을 통해 분석하였다(Fig. 3). TSWV에 감염증세를 보이는 고추 식물체로부터 바이러스 추출물을 얻었다. 건전주에서 추출물에 대비하여 TSWV 항체에 특이적으로 반응하여 추출물이 TSWV를 함유한 것을 확인하였다(Fig. 3A). 이 바이러스 추출물을 파총채벌레유충에 섭식시킨 후 건전한 고추에서 발육시켜 성충에 도달하였을 때 다시 western blotting 분석을 하였다. 예상대로 건전주 추출물을 섭식한 개체에 비해 바이러스 감염 추출물을 섭식하여 발육된 성충에서 항체 특이적 반응을 보였다.

Fig. 3. 
Infection of TSWV and multiplication in T. tabaci. (A) Infection of TSWV by feeding the plant extract. The extract was fed at the first instar and western analysis was performed at adult stage. Each lane contained 10 μg of proteins. ‘Plant’ indicates the extract of hot pepper exhibiting TSWV symptom, where ‘+’ and ‘-’ represent positive and negative symptom, respectively. ‘Thrips’ larvae were fed (‘+’) or not fed (‘-’) with the extract. (B) Detection of TSWV with specific antibody in the midgut (‘MG’) and salivary gland (‘SG’) of the adults treated with TSWV. (C) Quantification of TSWV titers at different developmental stages: the first and second instar larvae (‘L1’ and ‘L2’), prepupal (‘PP’), pupal (‘P’), and adult (‘A’).

TSWV 보독 성충에서 이 바이러스의 체내 분포를 면역형광기술로 분석하였다(Fig. 3B). 상이한 형광물질인 rhodamine과 DAPI로 세포질과 핵을 염색시켜 파총채벌레의 소화관과 침샘 부위를 확인하였다. 여기에 다시 TSWV에 특이적으로 반응한 항체에 FITC로 검출하였을 때 침샘을 중심으로 관찰되었으며 소화관의 여러 영역에서 이 바이러스가 검출되었다.

TSWV에 감염된 파총채벌레 체내에서 이 바이러스의 증식이 일어나는지 분석하기 위해 앞에서와 같이 1령충 시기에 바이러스를 감염시키고, 이후 건전주에서 발육시키면서 바이러스의 함량변화를 RT-qPCR로 추적하였다(Fig. 3C). 섭식 직후 6시간 경과 후 분석한 바이러스 함량은 총채벌레 개체당 약 13,500개 바이러스 밀도로 나타났다. 그러나 24시간이 경과하면서 바이러스 함량은 약 50% 증가하였다. 이후 2령충 시기에 바이러스 함량은 낮아지다가 전용 단계에서 급격하게 바이러스 함량이 증가하였다. 성충에 이르면서 이러한 바이러스 함량은 다시 줄어들어 1령 시기의 바이러스 밀도를 유지하게 되었다.