Editorial Board

실험에 이용한 소나무재선충은 경남 진주의 소나무재선충 감염목으로부터 깔때기법으로 분리해 직접 사용하거나 분리후 소나무재선충의 먹이인 잿빛곰팡이병균(Botrytis cineria)을 이용하여 실내에서 배양 후 깔때기법으로 분리하여 사용하였다(Kishi, 1995; Lee et al., 2006).

방선균 분리를 위한 토양 채집은 충북 영동, 충남 태안군 안면도, 경북 문경과 상주의 산림에서 채집하였다. 채집한 토양은 상온에서 24시간 건조 후 토양 10 g을 멸균 증류수 90 ml가 들어있는 삼각플라스크에 넣고, 30분 동안 20°C에서 진탕 배양 후 시료를 10⁻³까지 10배 단위로 단계적으로 멸균 증류수를 이용하여 희석한 후 희석액 50 μl를 취하여 방선균 분리용 배지(Actinomycete Isolation Agar, Difco^TM)에 분주하여 도말 후 20°C의 배양기(HB-303DH-0, Hanbaek Scientific Co.)에 배양하면서 전형적인 방선균 균총을 형성하는 균을 분리하여 사용하였다.

고체 배지에서 배양하던 방선균의 균총을 yeast mold broth (YM broth 21 g/l) 200 ml가 들어있는 삼각플라스크에 접종한 후 진탕배양기(23°C, 130 rpm)에서 약 10일간 진탕 배양 후 멸균한 filter paper (150 mm, Advantec No.2)를 이용하여 배양액을 여과하여 실험에 이용하였다. 배양 여액은 4°C 냉장고에 보관하면서 사용하였다. 실험에 이용한 방선균의 균주는 총 32균주로서 Table 1과 같다.

방선균의 살선충 활성을 검정하기 위하여 12 well cell culture plate (85.4 × 127.6 mm, SPL)에 소나무재선충 현탁액(100마리/0.5 ml)을 0.5 ml씩 분주한 후 방선균 배양 여액 원액을 0.5 ml씩 처리하였다. 무처리는 소나무재선충 현탁액 0.5 ml와 멸균 증류수 0.5 ml를 처리하였다. 처리 후 상온에서 48시간 방치 후 해부현미경(SMZ800, Nikon)으로 선충의 치사 여부를 조사하였다. 선충의 치사 여부는 핀으로 자극하였을 때 반응이 없는 것은 죽은 것으로 간주하였으며, 본 실험은 4회 반복 실시하였다.

원액 처리구에서 효과가 좋았던 균주 15개를 선발하여 2, 3차 실험을 진행하였다. 실험은 1차와 동일하게 진행하였으며 방선균 배양 여액의 농도를 2차에서는 2배액, 3차에서는 5배액으로 희석한 후 각각 0.5 ml씩 처리하였다. 소나무재선충 현탁액은 0.5 ml당 100마리의 농도로 0.5 ml씩 처리하였다. 무처리는 멸균 증류수 0.5 ml와 소나무재선충 현탁액 0.5 ml를 처리하였다. 처리 후 상온에서 48시간 방치 후 해부현미경으로 선충의 치사 여부를 조사하였으며, 2, 3차 실험 모두 4회 반복 실험하였다.

방선균이 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각의 conical tube (50 ml, SPL)에 소나무재선충 현탁액(200마리/1 ml)을 5 ml씩 분주한 후 방선균 배양 여액 10배 희석액을 5 ml (방선균 배양 여액 0.5 ml +멸균 증류수 4.5 ml)씩 처리하였다. 무처리는 소나무재선충 현탁액 5 ml와 멸균 증류수 5 ml를 처리하였다. 처리 후 상온에서 48시간 방치 후 1ml씩 취하여 B. cineria가 충분히 자란 PDA (potato dextrose agar, Difco^TM)평판 배지에 접종 후 15일에서 30일 동안 24°C의 배양기(HB-303DH-0, Hanbaek scientific Co.)에 보관하였다. 소나무재선충의 증식 수를 알아보기 위하여 깔때기법으로 소나무재선충을 배지로부터 분리하여 해부현미경으로 조사하였다. 본 실험은 3회 반복 실시하였다.

방선균 배양 여액을 이용한 소나무재선충 증식 억제 실험에서 효과가 우수한 균주들 중 YD116 방선균 균주를 이용하여 농도별로 소나무재선충 증식억제 효과를 검토하였다. 살선충 활성 실험은 각각의 conical tube (50 ml, SPL)에 소나무재선충 현탁액(200마리/1 ml)을 5 ml씩 분주한 후 방선균 균주 YD116 배양 여액을 농도별(원액, 5, 10, 50, 500배 희석액)로 5 ml씩 처리하였다. 무처리는 소나무재선충 현탁액 5 ml와 멸균 증류수 5 ml를 처리하였다. 처리 후 상온에서 48시간 방치 후 1 ml를 취하여 해부현미경(SMZ800, Nikon)하에서 선충의 치사 여부를 조사하였다. 실험은 5 반복으로 수행하였다.

증식에 미치는 영향은 방선균이 소나무재선충의 증식에 미치는 영향 실험과 동일한 방법으로 수행하였으며 배양 여액의 농도는 원액과 5, 10, 50, 500배액으로 하여 수행하였고, 5회 반복으로 실험하였다.

소나무재선충에 대한 살선충 효과가 높았던 YD116 균주의 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 선발 균주의 chromosomal DNA를 분리한 후 primer 518F (5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3')와 800R (5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3') primer를 사용하여 94°C에서 1분간 denaturation, 60°C에서 1분간 annealing, 72°C에서 1분 30초 동안 polymerization시키는 조건에서 PCR로 증폭하였다. 증폭된 PCR 결과물을 0.8% agarose gel electrophoresis를 수행한 후 분리 정제하여 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 RDP (RNA database project)를 활용하여 분석하였다.

형태적 동정을 위하여 YM agar (YM broth 21 g + agar powder 15 g +증류수 1 l)에 24°C 배양기(HB-303DH-0, Hanbaek Scientific Co.)에서 1주일간 배양한 YD116 균주를 전처리 한 후 전계방출형주사전자현미경(FE-SEM, XL30S FEG, Philips)으로 사진을 촬영하였다.

소나무재선충의 증식에 미치는 영향에서 효과가 있었던 방선균 YD116 균주를 동정한 결과, Streptomyces atratus strain NRRL B-16927로 동정 되었다. S atratus에서는 glucose isomerase (Tashpulatova, 1990), hydrazidomycin (Ueberschaar, 2011)과 malate dehydrogenase (Rommel et al., 1989), N-acylamino acid racemase (Tokuyama et al., 1994)가 분리되었다. 이들 물질 중 세포 독성을 가지고 있는 hydrazidomycin과 유사한 물질이면서 구매가 용이한 hydrazine hydrate를 이용하여 소나무재선충에 대한 살선충 활성을 검정하였다. 살선충 활성은 상기의 실험들과 동일하게 수행하였다. 각각의 conical tube (50 ml, SPL)에 소나무재선충 현탁액(200마리/1 ml)을 5 ml씩 분주한 후 hydrazine hydrate를 2, 20, 200, 2000ppm 농도로 5 ml씩 처리하였다. 무처리는 소나무재선충 현탁액 5 ml와 멸균 증류수 5 ml를 처리하였다. 처리 후 상온에서 48시간 방치 후 1 ml를 취하여 해부현미경(SMZ800, Nikon)으로 선충의 치사 여부를 조사하였다. 실험은 5 반복으로 수행하였다.

Hydrazine hydrate가 소나무재선충의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 농도별로 실내 스크리닝 실험에 이용하고 남은 5 ml 중 각각 1 ml 씩 취하여 B. cineria가 충분히 자란 PDA (potato dextrose agar, Difco^TM)평판 배지에 접종 후 20일 동안 24°C의 배양기(HB-303DH-0, Hanbaek Scientific Co.)에 보관하였다. 소나무재선충의 증식 수를 알아보기 위하여 밀도를 조사하였는데 깔때기법을 이용하여 소나무재선충을 배지로부터 분리하여 해부현미경으로 조사하였다. 각 처리구 모두 4 반복씩 수행하였다.

실험 결과는 Tukey's HSD test로 처리평균간 차이를 분산 분석하였다(Analytic software, 2003). 결과는 평균 ± 표준편차로 표기하였다.

방선균 배양 여액 2배액의 소나무재선충에 대한 살선충활성은 Table 2와 같다. 상주 갑장산 지역에서 분리한 SG4, SG7, SG8, SG16, SG17 균주의 보정사충률이 100%를 나타내었으며 전체적으로 보정사충률이 90% 이상인 처리구는 모두 21개 였다(df=33, 102, F=82.1, P<0.0001). 이들 균주들 중 효과가 높은 15 개의 균주를 선발하여 2차와 3차 살선충 활성을 검정하였다(Table 3).

2배액에서 효과가 높았던 15개 방선균 균주를 이용하여 4배액에서 소나무재선충에 대한 살선충 활성을 검정한 결과, SG16 균주의 보정사충률이 81.3%로 가장 높았으며 YD419 균주를 비롯한 10개 균주가 70% 이상의 보정사충률을 보였다(Table 3; df=15, 48, F=61.1, P<0.0001).

방선균 배양액 10배액에 대한 소나무재선충 살선충율은 전체적으로 20~50%대로 낮았는데 MS415 균주와 SG16 균주의 보정사충률이 가장 높았다(Table 3; df=15, 48, F=12.4, P<0.0001).

방선균 배양 여액이 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 20배액 배양 여액에 대한 상대적 증식 증가율을 알아본 결과는 Table 4와 같다. AM210, SG16, YD116, YD315 균주에서 소나무재선충의 증식률이 10% 미만으로 다른 처리에 비하여 증식억제 효과가 높았다(df=32, 66, F=16.8, P<0.0001).

방선균 균주의 배양 여액 중에서 소나무재선충의 증식 증가율이 낮았던 방선균 중 YD116 균주를 선별하여 농도별 살선충 활성을 검정한 결과는 Table 5와 같다. 배양 여액 2배 희석액에서는 모든 소나무재선충이 치사되었으나 10배액에서는 38.8%의 보정사충률을 보였고, 20배액 이상에서는 치사율이 급격히 낮아졌다(df=5, 24, F=137, P<0.0001).

YD116 균주 배양 여액에서 소나무재선충의 증식 수를 조사한 결과는 Table 5와 같았다. 2배액에서는 증식이 전혀 이루어지지 않았으며 10배액에서 1000배액까지는 증식은 이루어졌으나 무처리 대비 증식억제율은 98.7% 이상으로 높게 나타났다(df=5, 12, F=7.3, P<0.005).

증식 억제 효과가 뛰어난 YD116 균주를 16S rDNA의 염기서열을 분석하여 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK와 RDP (RNA database project)의 ribosomal RNA sequencing과 비교한 결과, Streptomyces atratus strain NRRL B-16927과 100%의 상동성을 보였으며 S. sanglieri strain NBRC 100784와는 99%의 상동성을 보였다(Fig. 1). 이에 따라 선발된 균주는 S. atratus YD116으로 명명하였다.

YD116 균주의 형태적 특징은 Yeast Mold 배지 상에서 초기에는 연노란색의 투명한 기중균사를 형성하다 이후 흰색의 기중 균사를 형성하였고, 기중 균사의 두께는 0.7 μm 내외로 일부가 코일처럼 말리는 모양을 형성하였다(Fig. 2A). 성숙해진 균사는 0.7 μm 내외로 분할되어 포자를 형성하였다(Fig. 2B). 이러한 특징은 Shibata et al. (1962)이 보고한 S. atratus와의 형태적 특징과 유사하였다.

Fig. 1. 
16S rDNA sequences of Actinomycetes YD116 isolate. This isolate was identified as Streptomyces atratus based on the 100% similarity to the species.

Fig. 2. 
FE-SEM(Field emission scanning electron microscope) images of Streptomyces atratus YD116. A; Some aerial mycelium were formed loop or open loop form. B; Spore was made from aerial mycelium devide.

방선균 배양 여액 중 소나무재선충의 증식 억제 효과가 높았던 YD116을 동정한 결과 S. atratus YD116으로 동정되었는데 S. atratus에서는 다양한 물질들이 확인되어 있다. 이들 중 세포독성을 가지는 것으로 알려진 hydrazidomycin과 유사한 hydrazine hydrate를 이용하여 농도별로 소나무재선충의 살선충 활성을 검정한 결과 Table 6과 같이 농도별로 차이를 보였는데 100 ppm 이상에서 87.9% 이상의 보정사충률을 보였다(df=4, 20, F=62.4, P<0.0001).

Hydrazine hydrate를 이용하여 소나무재선충 증식에 미치는 영향을 검정한 결과는 Table 6과 같이 1000 ppm에서는 증식이 일어나지 않았으나 통계적 유의성은 없었다(df=4, 10, F=3.43, P<0.0518).